El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris,

caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre:

(a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos,

(h) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

(i) un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

Genes de la remolacha azucarera involucrados en la tolerancia al estrés Campo de la invención La presente descripción se relaciona con el campo de la biología molecular en plantas, más particularmente con el uso de genes y proteínas de la remolacha azucarera, capaces de conferir un fenotipo en células eucariotas u organismos de tolerancia a situaciones de estrés, por ejemplo, toxicidad por sales minerales provocada por iones tales como Na+ o Li+.

Antecedentes La salinidad del suelo es uno de los estreses abióticos más significativos para la agricultura de plantas y por lo tanto, sería útil para identificar y aislar genes de tolerancia al estrés para el objetivo práctico de mejorar genéticamente la tolerancia a la salinidad de los cultivos.

Otros dos estreses abióticos importantes, la sequía y el frío, están íntimamente relacionados con el estrés por salinidad. Muchos de los genes que son regulados por el estrés por salinidad son también sensibles al estrés por sequía o por frío (Zhu, 1997) , por lo tanto, estos genes son particularmente interesantes para el mejoramiento genético de la tolerancia al estrés.

Los mecanismos moleculares por medio de los cuales las plantas responden al estés por salinidad están empezando a ser dilucidados (Hasegawa et al. 2000a) . Los transportadores de sodio en la membrana de la vacuola y del plasma, identificados como los productos de los genes NHX1 y SOS1 de Arabidopsis (Gaxiola et al. 1992, Íbside et al. 1999) y SOS1 (Shi et al. 2000) , respectivamente, han sido descritos como importantes determinantes de la tolerancia a la sal.

Para lograr el objetivo de mejorar genéticamente la tolerancia al estrés en las plantas es importante utilizar genes de tolerancia al estrés que cuando se introducen pueden conferir inmediatamente tolerancia al estrés. La acción de estos genes puede no ser dependiente de otros eventos relacionados con la ruta u otros componentes que sean necesarios para el mecanismo molecular de la tolerancia al estrés. Se puede identificar los factores importantes causantes del estrés en el organismo estresado, pero la pregunta sigue siendo si estos genes también contribuirán a mejorar la tolerancia al estrés en un huésped heterólogo cuando se los aisla y transfecta dentro del mismo.

La remolacha azucarera (genes) y estrés Se sabe que Beta vulgaris L. (Chenopodaceae, remolacha azucarera) , es más bien una planta resistente al estrés cuando se la compara con otras plantas, por ejemplo, Arabidopsis thaliana. Las remolachas azucareras son relativamente hablando bastante resistentes a la sal y a la sequía. Los genes que son los responsables de la capacidad de la remolacha azucarera para crecer en condiciones más difíciles comienzan a ser dilucidados. Una primera indicación de que un gen bajo investigación podría estar implicado en la inducción de resistencia, es el aumento de su expresión bajo condiciones de estrés. Como ejemplo, Matías et al. (1996) mostraron que el estrés por salinidad induce la mayor expresión de la H+ATPasa tipo V en las hojas maduras de la remolacha azucarera. También la betaína, un osmoprotector, es acumulada por muchas plantas de remolacha en respuesta a la salinidad y a la sequía. Además, en la remolacha azucarera, la expresión de Colina monooxigenasa, que cataliza la etapa comprometedora en la síntesis de la betaína derivada de la glicina de la remolacha azucarera, también es inducida por estrés osmótico en Chenopodaceae. Los niveles de ARNm en las hojas se incrementan de 3 a 7 veces con una concentración de sal de 400 mM y retorna a niveles no inducidos (Russel, 1998) . Como se mencionó anteriormente, existen diferentes rutas alternativas para responder a situaciones de estrés y por lo tanto, muchos genes diferentes están probablemente implicados en las respuestas al estrés.

Resumen de la invención La presente invención provee un objetivo como el expuesto en todos y cada uno de los numerales (i) hasta (xxxiii) a continuación:

(i) El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris, caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre:

(a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la

misma,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos,

(h) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

(i) un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

(ii) El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris como el expuesto en el numeral (i) más arriba en donde dichas células de levadura se derivan de la cepa JM26 de levadura sensible al Na+.

(iii) Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión o alteración de la expresión de cualquier ácido nucleico como el expuesto en el numeral (i) más arriba en células, tejidos o partes de dicha planta.

(iv) Un método como el expuesto en el numeral (iii) más arriba en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor.

(v) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por salinidad.

(vi) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por sequía.

(vii) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por una helada.

(viii) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales (iii) o (iv) más arriba en donde dicho estrés osmótico es provocado por frío.

(ix) Un método como el expuesto en uno cualquiera de los numerales de (iii) hasta (viii) más arriba en donde dicho método conduce a un aumento en el rendimiento.

(x) Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta seleccionada entre una de las siguientes:

(a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que hibrida especialmente con el ácido nucleico del numeral (a) o (b) bajo condiciones muy rigurosas,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntical a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g) un ácido nucleico que se diferencia de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8, o que se diferencia de un ácido nucleico como el definido... [Seguir leyendo]

1. El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión de dicho ácido nucleico de Beta vulgaris, caracterizado porque confiere tolerancia al estrés osmótico a las células de levadura, y en donde dicho ácido nucleico de Beta vulgaris se escoge entre:

(a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones rigurosas,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntico a la secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en uno cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre los organismos,

(h) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que se diferencia de un ácido nucleico como se define en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

(i) un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, AND genómico o AND sintético.

2. El uso de un ácido nucleico de Beta vulgaris de acuerdo con la reivindicación 1 en donde dichas células de levadura se derivan de la cepa de levadura JM26 sensible al Na+.

3. Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta que comprende la expresión o alteración de la expresión de cualquier ácido nucleico como se define en la reivindicación 1 en células, tejidos o partes de dicha planta.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurre bajo el control de un promotor.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por salinidad.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por sequía.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por congelación.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 en donde dicho estrés osmótico es provocado por frío.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 en donde dicho método conduce a un incremento en rendimiento.

10. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una planta seleccionada de uno de los siguientes:

(a) un ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN como la indicada en la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que contiene la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 3 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que hibrida específicamente con el ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de alta rigurosidad,

(d) un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 89% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8,

(e) un ácido nucleico que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en SEQ ID NO 8,

(f) un ácido nucleico que se degenera hasta un ácido nucleico como el indicado en la SEQ ID NO 3, o que se degenera hasta un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado del código genético,

(g) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias en el uso del codón entre organismos,

(h) un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico que codifica una proteína como la indicada en la SEQ ID NO 8,

o que difiere de un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (e) como resultado de diferencias entre los alelos, y

(i) un ácido nucleico como el definido en cualquiera de los numerales (a) hasta (h) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

11. Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que hibridan específicamente con un ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucleico de la reivindicación 10.

13. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10.

14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13 que es un vector de expresión en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente enlazada con una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicha secuencia en células huésped procariotas y/o eucariotas.

15. Una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 o un vector de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

16. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto, de hongo, de levadura, vegetal o animal.

17. Un polipéptido aislado que puede ser codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 10.

18. Un polipéptido de la reivindicación 17 que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8 o una secuencia de aminoácidos que s al menos 89% idéntica a una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEQ ID NO 8.

19. Un método para producir un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 15 ó 16 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido a partir del cultivo.

20. Un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 o un epítopo específico de dicho polipéptido.

21. Un método para la producción de células vegetales, tejidos vegetales o plantas alteradas que comprende la introducción de un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 directamente dentro de dicha célula vegetal o tejido o en un órgano de dicha planta.

22. Un método para efectuar la expresión de un polipéptido de la reivindicación 17 ó 18 que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 operativamente enlazada con una o más secuencias de control o un vector de la reivindicación 13 ó 14 en forma estable dentro del genoma de una célula vegetal.

23. Un método para la producción de células vegetales, tejidos vegetales o plantas transgénicas que comprende la introducción de un ácido nucleico de la reivindicación 10 en un formato expresable o un vector de la reivindicación 13 ó 14 en dicha célula vegetal, tejido vegetal o planta.

24. Un método para mejorar la tolerancia al estrés osmótico en una célula vegetal, tejido o planta que comprende la introducción de cualquier ácido nucleico como el identificado en la reivindicación 10 dentro de dicha célula vegetal, tejido u órgano de dicha planta.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal.

26. Una célula vegetal transgénica que contiene un ácido nucleico de la reivindicación 10 que está operativamente enlazado con elementos reguladores que permiten la transcripción y/o la expresión de dicho ácido nucleico en

células vegetales o en una célula vegetal transgénica que puede ser obtenida por medio de un método de la reivindicación 23.

27. Una célula vegetal transgénica de la reivindicación 26 en donde dicho ácido nucleico de la reivindicación 10 es 5 integrado en forma estable dentro del genoma de dicha célula vegetal.

28. Una planta o tejido vegetal transgénicos que contienen células vegetales de la reivindicación 26 ó 27.

29. Una planta transgénica de la reivindicación 28 que muestra mayor tolerancia al estrés osmótico, comparada con 10 la correspondiente planta de tipo silvestre.

30. Una parte cosechable de una planta de la reivindicación 28 ó 29, conteniendo dicha parte cosechable células vegetales transgénicas de la reivindicación 26 ó 27.

31. La parte cosechable de una planta de la reivindicación 30 que se selecciona de entre el grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas y bulbos.

32. La progenie derivada de cualquiera de las plantas o partes de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, y que contiene células vegetales transgénicas de la reivindicación 26 ó 27.

Figura 6

SEQ ID NO 1: Secuencia de AND del clon 154 BvCK2 del gen de la remolacha roja (subunidad catalítica a de la caseína quinasa)

SEQ ID NO 2: Secuencia de ADN del clon 35 BvDHO del gen de la remolacha roja (dihidroorotasa)

SEQ ID NO 3: Secuencia de ADN del clon 76 BvelF-1A del gen de la remolacha roja (Factor 1A de iniciación de la traducción)

10 SEQ ID NO 4: Secuencia de ADN del clon 120 Bv120 del gen de la remolacha roja (proteína putativa)

SEQ ID NO 5: Secuencia de ADN del clon 20Li Bv20Li del gen de la remolacha roja (proteína desconocida)

SEQ ID NO 6: Secuencia de aminoácidos del clon 154 BvCK2 del gen de la remolacha roja (subunidad catalítica a de la caseína quinasa)

SEQ ID NO 7: Secuencia de aminoácidos del clon 35 BvDHO del gen de la remolacha roja (dihidroorotasa)

SEQ ID NO 8: Secuencia de aminoácidos del clon 76 BvelF-1A del gen de la remolacha roja (Factor 1A de iniciación de la traducción)

SEQ ID NO 9: Secuencia de aminoácidos del clon 120 Bv120 del gen de la remolacha roja (proteína putativa)

SEQ ID NO 10: Secuencia de aminoácidos del clon 20Li Bv20Li del gen de la remolacha roja (proteína desconocida)