SINTESIS PEPTIDICA DE HELICES ALFA SOBRE RESINA DE PEG.

Método para preparar un péptido sobre una fase sólida, péptido que tiene al menos 24 residuos de aminoácido de longitud y péptido que puede tener cadenas laterales de aminoácido individualmente protegidas y/o desprotegidas,

caracterizado porque dicho péptido se prepara unido a una fase sólida, fase sólida que es una resina de PEG anfifílica que comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al menos 12 residuos de longitud

Síntesis peptídica de hélices alfa sobre resina de PEG.

La presente invención se refiere a un método para sintetizar tipos particulares de péptido sobre una fase sólida, y a los conjugados de péptido-fase sólida respectivos.

Un fármaco peptídico de éxito, que actúa como un inhibidor de una enfermedad viral humana extendida tal como la infección por HIV, es T-20 (también llamado DP-178), que es Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Tip-Asn-Trp-Phe-NH₂. La secuencia del péptido se toma de un segmento de secuencia fusogénica a-helicoidal, la llamada repetición heptádica, correspondiente a los aminoácidos 638-673 de la proteína receptora de transmembrana gp41 de HIV-1. Gp41 es crucial para mediar en la infección viral de células.

De acuerdo con esto, es necesaria la producción eficaz a gran escala, pero hasta ahora sólo se ha alcanzado mediante una combinación de síntesis parcial de segmentos de T-20 sobre una fase sólida, seguida por condensación de segmentos típicamente en fase líquida (véase WO 99/48513). La síntesis eficaz de longitud completa sobre una fase sólida no se ha demostrado hasta ahora, fallando típicamente tal sistema en la producción de más producto apropiado que productos secundarios inútiles, planteando la purificación de impurezas problemas adicionales y disminuyendo de nuevo los rendimientos finales.

Tam, J. et al. (Dep. Microbiology Vanderbilt University; Organic Letters 2002, Vol. 4; 4167-4170) describen, entre otras cosas, la preparación de DP-178 y péptidos 30-me relacionados con el propósito de preparar haces de tres hélices. Los autores solo mencionaban que se aplica un método de síntesis general con FMOC, dando los reactivos de acoplamiento y las condiciones de escisión de la resina usados. No se menciona nada sobre el tipo de resina y/o asidero de resina empleado, como tampoco del exceso de reactivos usado. No se muestra el cromatograma y no se dan detalles de la purificación ni la pureza final. No se da una indicación de los rendimientos obtenidos y se deja que sean totalmente objeto de especulación. Puesto que el trabajo trataba sólo de la experimentación a escala de laboratorio, no se daba una necesidad evidente de idear un procedimiento sintético eficaz.

Un objetivo de la presente invención es idear un método eficaz mejorado para la síntesis de tales proteínas a-helicoidales y en particular T-20. Este objetivo se soluciona mediante el método de la presente invención.

De acuerdo con el método de la presente invención para preparar un péptido, comprende la etapa en la que dicho péptido que puede tener cadenas laterales de aminoácidos protegidas y/o desprotegidas se prepara unido a una fase sólida, fase sólida que es una resina de PEG anfifílica y en donde el péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina, que consiste en una serie de seis residuos de aminoácido contiguos que comprenden al menos cuatro residuos de aminoácido formadores de hélice protegidos o desprotegidos.

La Fig. 1 muestra el cromatograma de HPLC y el bajo nivel de impurezas obtenido del producto sintetizado de este modo, admitida una síntesis de alto rendimiento.

Las resinas de PEG son ofrecidas por diferentes compañías, p. ej. Matrix Innovations Inc. de Quebec, Canadá (marca ChemMatrix) o Versamatrix A.S. de Dinamarca. Tipos preferidos de resinas de PEG se han descrito en WO 02/40559. Para la conexión del péptido, tal resina de PEG puede comprender radicales hidroximetilo naturales terminales o derivados de los mismos, por ejemplo radicales aminometilo, carboxilo o bromometilo o yodometilo cuasi naturales, o puede derivarse mediante conectores o asideros integrales o injertados conocidos para la conexión en fase sólida, tales como, p. ej., resinas de Wang, ácido 4-hidroximetilbenzoico (requiriendo el último la ligazón del primer aminoácido por medio de esterificación catalizada por p-dimetilaminopiridina, véase Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Chem. Commun., p. 336 y siguientes), cloruro de 2-clorotritilo (CTC) y resinas de haluro de tritilo relacionadas, preferiblemente alcoxiladas, conector de 4-carboxitritilo de Bayer, resina de 4-metilbencilhidrilamina, o, p. ej., los conectores amídicos PAL, Rink o Sieber generadores de amida que se usan en la química del Fmoc, o cuando ha de usarse la química del Boc, p. ej. el asidero Pam o el asidero de BHA generador de amida.

Preferiblemente, la resina de PEG usada en la presente invención comprende un conector que comprende un radical NH reactivo que genera durante la escisión del péptido de la resina una amida de ácido, serlo después del acoplamiento inicial de la función ácido Ca-carboxílico del residuo de aminoácido C-terminal del péptido a tal conector o serlo a partir de la función de la cadena lateral de ácido ?-carboxílico de ácido aspártico o glutámico, dando asparagina o glutamina durante la escisión después del anclaje inicial de la cadena lateral y la protección del extremo C del péptido. En el presente contexto, tales conectores se denominan conectores generadores de amida. Más preferiblemente, y particularmente para la síntesis de T-20, tal conector generador de amida es PAL (Albericio et al., 1987, Int. J. Pept. Protein Research 30, 206-216), Sieber (Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110) o un conector de resina de tipo 9-aminoxantenílico, o un conector de amida de Rink (4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi; Rink et al, 1987, Tetrahedron Lett. 28 3787 y siguientes).

La resina de PEG es una resina de PEG sustancialmente pura que carece de restos poliestireno finalmente más sustituidos como un elemento estructural definitorio y, además, tampoco comprende ningún grupo funcional éster o amida interno sino solo grupos funcionales poliéter. Notablemente, en la última definición, no se tienen en cuenta los enlaces éster o amida terminales que sirven de puente a la resina directamente o a través de un asidero con el péptido, ya que no son elementos reticuladores estructurales internos y, de acuerdo con esto, no afectan a la definición de PEG puro a este respecto.

Las resinas de PEG ofrecen una estabilidad química óptima junto con buena compatibilidad y facilidad de manejo con disolventes estándar durante la síntesis normal con Fmoc. De acuerdo con la presente invención, permiten sintetizar, p. ej., T-20 con un rendimiento y una pureza excepcionales.

Un segmento formador de hélice comprende residuos de aminoácido formadores de hélice según se definieron anteriormente; residuos formadores de hélice en su significado en el presente contexto son los que equivalen a formadores de hélice fuertes, es decir, que están indicados como Ha o aminoácido tipo ha en el esquema de indicación y predicción de la propensión de la hélice de acuerdo con Chou y Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47, 25 8 (1975). Tales formadores de hélice fuertes simplemente tienen una propensión helicoidal determinada empíricamente de >1 que indica que tal residuo de aminoácido formador de hélice fuerte se presenta con una frecuencia mayor que la media en una hélice a en estructuras proteínicas determinadas por rayos X. Para cada uno de los 20 aminoácidos naturales, un valor numérico empírico de propensión puede encontrarse tabulado en Chou, anteriormente. De acuerdo con esto, formadores de hélice fuertes son Ala, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Trp y Val. En contraste, His, Arg y Asp se presentaban con frecuencia estadística, significando una propensión de aproximadamente 1, en hélices a, mientras que se encontró que Asn tiene un impacto verdaderamente negativo sobre la formación de hélices, a saber, una propensión de solamente 0,67. Para la predicción de segmentos peptídicos helicoidales o formadores de hélice, un algoritmo de predicción comparativamente simple pero fiable fue definido por Chou et al, 1978: Una agrupación de 4 residuos de aminoácido fuertemente formadores de hélice, con la regla de excepción de que dos His y/o Asp suplen a un residuo formador de hélice fuerte, dentro de los seis residuos de aminoácido contiguos nucleará una hélice. Calculando la propensión media de la hélice para cada segmento tetrapeptídico solapado de tal segmento helicoidal puede predecirse entonces que tal hélice se extenderá en ambas direcciones hasta que la propensión promediada para el segmento tetrapeptídico terminal caiga por debajo de 1,00. Las prolinas son rompedores de hélice y solo pueden presentarse en los extremos de una hélice. Preferiblemente,...

1. Método para preparar un péptido sobre una fase sólida, péptido que tiene al menos 24 residuos de aminoácido de longitud y péptido que puede tener cadenas laterales de aminoácido individualmente protegidas y/o desprotegidas, caracterizado porque dicho péptido se prepara unido a una fase sólida, fase sólida que es una resina de PEG anfifílica que comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al menos 12 residuos de longitud.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la capacidad de carga de la resina de PEG es al menos 0,5 mmol/g.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la longitud total del péptido que ha de sintetizarse, y péptido que comprende los segmentos peptídicos helicoidales mencionados anteriormente, es al menos 30 aminoácidos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es T-20, T-20 acetilado N-terminalmente, timosina-aI o es un péptido de repetición heptádica de 15-40 residuos de aminoácido que tiene un elemento de secuencia fusogénica a-helicoidal que está solapado con T-20 en al menos 10 residuos.

5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el péptido se conecta a la fase sólida a través de un conector o asidero funcional.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el conector es un conector generador de amida, preferiblemente es un conector de amida de Sieber o Rink.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la resina de PEG es una resina de PEG funcionalizada con aminoalquilo, función amino a la que el péptido está unido formando una peptidilcarboxamida Ca-terminal.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 5, caracterizado porque la resina es una resina de PEG, en donde la resina no es un poliestireno-PEG mixto o un copolímero o un copolímero de bloques, preferiblemente porque la resina es una resina de PEG sustancialmente pura.

9. Conjugado de un péptido de al menos 24 residuos de aminoácido y una fase sólida de resina de PEG sustancialmente pura, resina que es una resina de PEG anfifílica que comprende sólo grupos funcionales poliéter como un elemento estructural de reticulación interna y en donde el péptido comprende un segmento formador de hélice, libre de prolina, que tiene al menos 12 residuos de longitud.

10. Conjugado de péptido-resina de PEG de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el resto peptídico tiene la secuencia de aminoácidos R1 Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Oln-Gln-Glu-Lys-Asn-Gln-Glu-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala=Ser-Leu-Tip=Asn-Trp-Phe y en el que R1 es H, acetilo o un grupo protector retirable, lo más preferiblemente R1 es acetilo, y en el que los residuos de aminoácido individuales pueden comprender además un grupo protector de cadena lateral.

11. Conjugado de péptido-resina de PEG de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el resto peptídico es timosina-a1.