La invención se relaciona con la recuperación de la capacidad de presentación antigénica de tumores in vivo mediante.

la restauración de la expresión de moléculas HLA de clase I empleando para ello vectores adenovirales. La misma será realizada en aquellos tumores totalmente negativos para la expresión de moléculas HLA de clase I debido a alteraciones en la B2-microglobulina, implicando el diagnóstico previo de la alteración presente en el tumor

Restauración de las moléculas HLA de clase I mediante terapia génica empleando vectores adenovirales portando el gen de la ß2-microglobulina.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a la generación de vacunas adenovirales que restauren la expresión de moléculas HLA de clase I en tumores generando un incremento de la capacidad de presentación antigénica de la célula tumoral.

Estado de la técnica

Antígenos tumorales y la inmunovigilancia

La presencia de antígenos específicos de tumor fue en principio demostrada sometiendo a los animales a fuerte dosis de carcinógenos químicos (Prehn, R.T., and J.M. Main. 1957. "Immunity to methylcholantreno-induced sarcomas". J Natl Cancer Inst 18:769), a virus oncogénicos (Klein, E and G. Klein. 1964. "Antigenic properties of lymphomas induced by Moloney agent". J. Natl Inst. 32: 547) o a radiación ultravioleta (Kripke, MI. 1974 "Antigenicity o murine skin tumors induced by ultraviolet light". J. Natl Cancer Inst. 53:1333-1336). Estos y otros múltiples estudios permitieron a Burnet generar la hipótesis de que el sistema inmune reconoce y elimina tumores en desarrollo basado en el reconocimiento de neoantígenos generados en el proceso de la transformación maligna (Burnet, F.M. 1970. "The concept of immunological surveillance". Prog. Exp. Tumor Res. 13:1-27).

Dada la existencia de los antígenos tumorales capaces de ser reconocidos por el sistema inmune, una parte de las investigaciones en los últimos años en el cáncer, han estado enfocadas a conocer los mecanismos que conducen al sistema inmune a evadir el reconocimiento tumoral o a adquirir una tolerancia progresiva durante su desarrollo.

Los componentes efectores del sistema inmune están implicados en la respuesta inmunológica desarrollada frente al cáncer, siendo los mas destacado la respuesta citotóxica celular llevada por linfocitos T citotóxicos (CTLs) y células NK. Esta respuesta efectora va a ser generada en la medida que se produzca el reconocimiento inmunológico de las células tumorales llevado a cabo por los linfocitos T. Este proceso está condicionado a la expresión de moléculas HLA de clase I por parte de la célula tumoral. La función principal de estas moléculas es la presentación de pequeños péptidos, producto de la degradación de proteínas del interior celular, a los linfocitos T en contexto de su receptor (TCR). La habilidad de los linfocitos T para reconocer epitopos peptídicos derivados del citoplasma, proteínas nucleares, antígenos tumorales en el contexto de las moléculas HLA de clase I, permite el reconocimiento por parte del sistema inmune de alteraciones celulares provocadas por el proceso maligno y la consecuente respuesta efectora.

El hecho de que las moléculas del MHC desempeñan un papel esencial en el reconocimiento de los antígenos proteicos por las células T, (Doherty, P.,C., M.B. Dunlop, C.R. Parish, and R.M. Zinkernagel. 1976. "Inflamatory process in murine lymphocytic choriomeningitis is maximal in H-2K or H-2D compatible interactions". J. Immunology. 117:187-190) llevó a muchos laboratorios a realizar un enorme esfuerzo para aclarar la estructura de estas moléculas y el fenómeno de la presentación antigénica.

Existen dos grandes vías de procesamiento y presentación antigénica; una usada para la presentación de moléculas extracelulares y moléculas asociadas a membranas de la célula y otra para la presentación de péptidos generados a partir de la degradación de macromoléculas presentes en el citosol celular (vía endógena). La primera vía descrita genera péptidos que son presentados mediante las moléculas MHC de clase II a linfocitos T CD4+. La segunda vía genera péptidos para ser presentados por moléculas pertenecientes al MHC de clase I que son reconocidos por linfocitos T CD8+. Ambos tipo de moléculas, están localizadas en el complejo mayor de histocompatibilidad, ubicados en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3) (Breuning, M.,H., E.M. van den Berg-Loonen, L.F. Bernini, J.B. Bijlsma, E. van Loghem, P. Meera Khan, L.E. Nijenhuis. 1977 "Localization of HLA on short arm of chromosome 6". Hum Genet 37:131-139) constituido por un conjunto de cerca de 200 genes de los cuales aproximadamente 40 codifican para los antígenos HLA. Las moléculas HLA de clase I presentan péptidos derivados de proteínas citosólicas, sintetizadas en el interior celular, para su reconocimiento por linfocitos T CD8, el antígeno es procesado por la vía denominada endógena o biosintética. El ensamble de las moléculas HLA de clase I es un proceso de naturaleza secuencial, en un orden cronológico específico lo cual permite un reporte continuo del contenido celular a los CTLs.

La respuesta específica de linfocitos T citotóxicos (CTLs) juega un papel predominante en el control del crecimiento tumoral, la misma ha sido observada en ausencia de respuesta clínica. La aparición de variantes menos antigénicas así como interferencias con el proceso de presentación antigénica puede afectar la capacidad de las células tumorales para ser dianas de CTLs al modular la sensibilidad de las células tumorales a los CTLs, como a la disminución de su actividad citotóxica.

Desde el último cuarto del siglo pasado es ampliamente conocido el hecho de que las células tumorales pueden perder la expresión de moléculas HLA de clase I por una gran variedad de mecanismos, durante la progresión tumoral (Festenstein, H. 1987. "The biological consequences of altered MHC expression on tumours". Br Med Bull. 43:217-227).

Su estudio retomó interés nuevamente en el inicio de la década de los 90, cuando fue puesto de manifiesto el papel de los antígenos de clase I del MHC en el reconocimiento de las células tumorales por CTLs (Crowley, N.,J., T.L. Darrow, M.A. Quinn-Allen, H.F. Sigler. 1991. "MHC-restricted recognition of autologous melanoma by tumor-specific cytotoxic T cells". Evidence for restriction by a dominant HLA-A allele. J Immunol 146:1692-1699) y la implicación de estas células efectoras en el establecimiento de la inmunoterapia específica de células T en el tratamiento del cáncer (Boon, T, P.G. Coulie, B. Van den Eynde. 1997. "Tumor antigens recognized by T cells". Immunol Today 18:267-268).

Los estudios iniciales de las moléculas HLA fueron difíciles de realizar, por la carencia de los reactivos adecuados. El desarrollo de la metodología de hibridomas y anticuerpos monoclonales conjuntamente con el advenimiento de las técnicas inmunohistoquímicas ayudó a caracterizar mejor estas alteraciones al poder analizar su expresión en tejidos criopreservados. El uso de anticuerpos que reconocían determinantes monomórficos, locus específicos y alelo específico en secciones criopresevadas de tumores permitió la identificación de distintos fenotipos de expresión alterada de moléculas HLA de clase I (Garrido, F., F. Ruiz-Cabello, T. Cabrera, J.J. Perez-Villar, M. Lopez-Botet, M. Duggan-Keen, P.L. Stern. 1997. "Implications for immunosurveillance of altered HLA class I phenotypes in human tumors". Immunol Today 18:89-95), (Ferrone, S., and F.M. Marincola. 1995. "Loss of HLA class I antigen by melanoma cells: Molecular mechanisms, functional significance and clinical relevance". Immunol Today 16: 487-494).

Estos estudios permitieron la clasificación de las alteraciones de las moléculas HLA clase I encontradas comúnmente en tejidos y líneas celulares tumorales, en fenotipos HLA alterados siendo los descritos hasta ahora el fenotipo I (pérdida total de expresión de antígenos HLA de clase I); fenotipo II (pérdida de haplotipo) fenotipo III (pérdida de expresión del locus); fenotipo IV (pérdida de expresión de alelos individuales). Algunos tumores pueden presentar fenotipos complejos que consisten en la combinación de uno o varios de los mecanismos antes mencionados (Fenotipo V) (Garrido, F., F. Ruiz-Cabello, T. Cabrera, J.J. Perez-Villar, M. Lopez-Botet, M. Duggan-Keen, P.L. Stern. 1997. "Implications for immunosurveillance of altered HLA class I phenotypes in human tumors". Immunol Today 18:89-95). Recientemente han sido descritos dos fenotipos nuevos: el fenotipo VI, en el que la célula tumoral es resistente a la acción del IFN-? y el fenotipo VII caracterizado por baja regulación de moléculas HLA de clase I y expresión de moléculas HLA no clásicas (Fig. 1).

Los mecanismos moleculares generadores de los fenotipos alterados de las moléculas HLA de clase I son diversos, probablemente como consecuencia de la inestabilidad genética característica del proceso tumoral.

Las células tumorales...

1. Construcción génica recombinante para estimular la respuesta antitumoral citotóxica que consiste en un sistema de expresión el cual incluye un vector viral portador de una secuencia polinucleotídica que codifica el gen de la ß2-microglobulina, caracterizado porque el vector viral es un adenoviruso un virus adeno-asociado y porque la secuencia polinucleotídica presenta al menos un 85% de homología con la secuencia SEQ ID NO 1.

2. Construcción génica recombinante para estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica presenta al menos un 90% de homología con la secuencia SEQ ID NO 1.

3. Construcción génica recombinante para estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica presenta al menos un 95% de homología con la secuencia SEQ ID NO 1.

4. Construcción génica recombinante para estimular la respuesta antitumoral citotóxica según la reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la secuencia polinucleotídica es la SEQ ID NO 1.

5. Uso de la construcción génica recombinante según las reivindicaciones 1-4 para la preparación de una vacuna antitumoral que consiste en una cantidad terapéuticamente efectiva de dicha construcción génica recombinante y un soporte farmacéuticamente aceptable.