PROCEDIMIENTO ENZIMATICO PARA LA REDUCCION ENANTIOSELECTIVA DE CETOCOMPUESTOS.
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0204143EP.
Solicitante: IEP GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: RHEINGAUSTRASSE 190-196,65203 WIESBADEN.
Inventor/es: GUPTA,ANTJE,DR, BREESE,KLAUS, BANGE,GERT, NEUBAUER,PETER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 23 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/04 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P41/00B
- C12P7/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › acíclicos.
- C12P7/62 C12P 7/00 […] › Esteres de ácidos carboxílicos.
- C12R1/19 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS. › C12R 1/00 Microorganismos. › Escherichia coli.
Clasificación PCT:
- C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/53 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P7/02 C12P 7/00 […] › que contienen un grupo hidroxilo.
Clasificación antigua:
- C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/53 C12N 15/00 […] › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
- C12P7/02 C12P 7/00 […] › que contienen un grupo hidroxilo.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento enzimático para la reducción enantioselectiva de cetocompuestos.
La presente invención se refiere a un procedimiento enzimático para la reducción enantioselectiva de cetocompuestos orgánicos para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales, a una alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus minor y a un procedimiento enzimático para la obtención enantioselectiva de (S)-hidroxicompuesto a partir de un racemato.
Los hidroxicompuestos ópticamente activos son componentes de síntesis valiosos para la producción de un gran número de compuestos farmacológicamente importantes. Estos compuestos son con frecuencia difíciles de producir mediante procedimientos químicos clásicos y pueden lograr sólo rara vez la pureza enantiomérica requerida para las aplicaciones farmacológicas. Por tanto, para la producción de compuestos quirales se emplean por regla general procedimientos biotecnológicos, realizándose la reacción estereoselectiva o bien con microorganismos completos o bien con enzimas aisladas.
A este respecto ha resultado ventajosa con frecuencia la utilización de enzimas aisladas, dado que con éstas pueden conseguirse por regla general rendimientos mayores así como una pureza enantiomérica mayor.
Las deshidrogenasas y especialmente las alcohol deshidrogenasas son catalizadores valiosos para la obtención de productos quirales mediante la reducción estereoselectiva de cetocompuestos orgánicos para dar los correspondientes alcoholes quirales. Esencialmente se conocen enzimas correspondientes de levadura, hígado de caballo o Thermoanaerobium brockii. Estas enzimas necesitan NADH (nicotinadenindinucleótido) o NADPH (nicotinadenindinucleótido fosfato) como coenzima. Otras alcohol deshidrogenasas conocidas son por ejemplo una alcohol deshidrogenasa (S)-específica de Rhodococcus erythropolis o una alcohol deshidrogenada (R)-específica del género Lactobacillus. Ambos tipos de enzimas tienen un amplio espectro de sustratos de cetocompuestos y presentan una alta enantioselectividad. Las alcohol deshidrogenasas de Lactobacillus kefir (documento DE 40 14 573) y Lactobacillus brevis (documento DE 196 10 984) son adecuadas especialmente para la obtención de (R)-alcoholes quirales.
Sin embargo para el empleo de las alcohol deshidrogenasas son desventajosas la estabilidad enzimática y la actividad enzimática reducidas de las alcohol deshidrogenasas en disolventes orgánicos y la solubilidad en agua con frecuencia sólo reducida de los cetocompuestos a reducir. Además, otro factor limitativo para el empleo de las alcohol deshidrogenasas en disolventes orgánicos es la utilización necesaria de NADP o NAD como cofactor requerido, dado que el cofactor (NADP, NAD) es soluble en agua y se regenera en procedimientos económicos.
La invención tiene como objetivo mejorar las desventajas mencionadas mediante la modificación de las condiciones de procedimiento. Este objetivo se soluciona según la invención mediante el uso de un sistema bifásico, que contiene un disolvente orgánico, alcohol deshidrogenasa, agua, cofactor y cetocompuesto.
El procedimiento según la invención presenta una alta durabilidad gracias a la acción estabilizadora de enzimas del disolvente, una pureza enantiomérica de más del 99,9% de los hidroxicompuestos quirales producidos y un alto rendimiento con respecto a la cantidad utilizada del cetocompuesto.
Por tanto, el procedimiento según la invención se refiere a un procedimiento para la reducción enantioselectiva de un cetocompuesto de fórmula I
en la que R1 y R2 independientemente entre sí son iguales o diferentes y representan
- 1. átomo de hidrógeno,
- 2. alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada,
- 3. alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
- 4. alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,
- 5. arilo (C6-C14),
- 6. alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14), o
- 7. R1 y R2 forman junto con el resto -C(O)- un arilo (C6-C14) o un heterociclo (C5-C14),
caracterizado porque
- a) el compuesto de fórmula I, la alcohol deshidrogenasa, agua, el cofactor y un disolvente orgánico con un logP de desde 0,5 hasta 4,0,
- b) se incuban en un sistema bifásico y
- c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
Átomos de carbono en el anillo. Los restos arilo (C6-C14) son por ejemplo fenilo, naftilo. Por el término arilo se entienden restos de carbono aromáticos con de 6 a 14 por ejemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, por ejemplo 2-bifenililo, 3-bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo. Restos bifenililo, restos naftilo y especialmente restos fenilo son restos arilo preferidos. Por el término "halógeno" se entiende un elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por la expresión "alquilo (C1-C20)" se entiende un resto hidrocarbonado, cuya cadena de carbono es de cadena lineal o ramificada y contiene de 1 a 20 átomos de carbono.
La expresión "heterociclo (C5-C14)" representa un anillo heterocíclico de 5 miembros a 14 miembros monocíclico o bicíclico, que está parcialmente saturado o completamente saturado. Ejemplos de heteroátomos son N, O y S. Ejemplos de las expresiones heterociclo (C5-C14) son restos que se derivan de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido, triazolona, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidindiona, triazoles, que están sustituidos con F, -CN, -CF3 o -C(O)-O-alquilo (C1-C4), 3-hidroxipirro-2,4-diona, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, carbolina y derivados benzo-anillados, ciclopenta-, ciclohexa- o ciclohepta-anillados de estos heterociclos. Se prefieren especialmente los restos 2- ó 3-pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4- ó 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por ejemplo 1-metil-2-, -4- ó -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-, 3- ó 4-piridil-N-óxido, 2-pirazinilo, 2-, 4- ó 5-pirimidinilo, 2-, 3- ó 5-indolilo, 2-indolilo sustituido, por ejemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5-benciloxi-, 5-cloro- o 4,5-dimetil-2-indolilo, 1-bencil-2- ó -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]-5-pirrolilo, 2-, 3- ó 4-quinolilo, 1-, 3- ó 4-isoquinolilo, 1-oxo-1,2-dihidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzotienilo, 2-benzoxazolilo o benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2- ó 3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para la reducción enantioselectiva de un cetocompuesto de fórmula I
en la que R1 y R2 independientemente entre sí son iguales o diferentes y representan
- 1. átomo de hidrógeno,
- 2. alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada,
- 3. alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
- 4. alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,
- 5. arilo (C6-C14),
- 6. alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14), o
- 7. R1 y R2 forman junto con el resto -C(O)- un arilo (C6-C14) o un heterociclo (C5-C14),
caracterizado porque
- a) un compuesto de fórmula I con un porcentaje de desde el 10% hasta el 25%, con respecto al volumen total de la mezcla de reacción, alcohol deshidrogenasa, agua, cofactor NADPH o NADH y un disolvente orgánico con un logP de desde 0,5 hasta 4,0;
- b) se incuban en un sistema bifásico de agua, disolvente orgánico y el compuesto de fórmula (I);
- c) se regenera continuamente el cofactor oxidado formado por la alcohol deshidrogenasa, y
- d) se aísla el hidroxicompuesto quiral.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza un compuesto de fórmula I de la serie éster etílico del ácido 4-cloro-3-oxo-butanoico, acetofenona, éster metílico del ácido acetoacético, 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo, 2,5-hexanodiona, piruvato de etilo o 2-octanona.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se utiliza un disolvente orgánico con un logP de desde 0,6 hasta 3,0, especialmente desde 0,6 hasta 1,9.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se utiliza un disolvente orgánico con un logP de desde 0,63 hasta 1,75.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como disolvente orgánico se utiliza dietil éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter o éster etílico del ácido acético.
6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se utiliza una alcohol deshidrogenasa de levadura, hígado de caballo, Thermoanaerobium brockii, Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Lactobacillus minor o una alcohol deshidrogenasa con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4.
7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se añade un tampón tal como tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina con un valor de pH de desde 5 hasta 10, preferiblemente con un valor de pH de desde 6 hasta 9.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque se añaden al tampón iones magnesio tales como MgCl2, en una concentración de desde 0,2 mM hasta 10 mM, preferiblemente de 0,5 mM a 2 mM.
9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque como cofactor se añade NADPH o NADH en una cantidad de desde 0,05 mM hasta 0,25 mM, especialmente desde 0,06 mM hasta 0,2 mM, con respecto a la fase acuosa.
10. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como estabilizador para la alcohol deshidrogenasa se agrega glicerina, sorbitol o dimetilsulfóxido.
11. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se agrega isopropanol.
12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los compuestos de fórmula I se utilizan en una cantidad de desde el 15% hasta el 22%, con respecto al volumen total.
13. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se realiza la reacción a una temperatura de desde aproximadamente 10ºC hasta 70ºC, preferiblemente desde 30ºC hasta 60ºC.
14. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque se utiliza el disolvente orgánico en una cantidad de desde el 1% hasta el 90%, con respecto al volumen total de la mezcla de reacción, preferiblemente desde el 15% hasta el 60%, especialmente desde el 20% hasta el 50%.
15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la razón del disolvente orgánico con respecto al agua asciende a desde 9 con respecto a 1 hasta 1 con respecto a 9, preferiblemente desde 1 con respecto a 1 hasta 1 con respecto a 3.
16. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se utiliza el estabilizador en una cantidad de desde el 5% hasta el 30%, con respecto al volumen de la mezcla de reacción total, preferiblemente desde el 10% hasta el 20%, especialmente del 20%.
17. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se utiliza isopropanol en una cantidad de desde el 5% hasta el 30%, con respecto al volumen de la mezcla de reacción total, preferiblemente desde el 10% hasta el 20%, especialmente del 10%.
18. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque se utiliza la alcohol deshidrogenasa en una cantidad de desde 20000 U hasta 200000 U por kg de compuesto de fórmula I que va a hacerse reaccionar, de manera preferible aproximadamente 100000 U.
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