OXIDORREDUCTASA DE PICHIA CAPSULATA.

Oxidorreductasa, que en presencia de NADH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

caracterizada porque más del 70% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 y presenta una actividad específica superior a 1 por mg de proteína, con respecto a la reacción de ácido etil-4-cloro-3-oxobutírico para dar ácido (R)-etil-4-cloro-3hidroxibutírico

La presente invención se refiere a una oxidorreductasa, a un procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes (S)-hidroxicompuestos y a un procedimiento para la obtención del (R)-hidroxicompuesto quiral. 5

Los hidroxicompuestos ópticamente activos son elementos estructurales quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente eficaces, sustancias aromáticas, feromonas, productos agroquímicos o inhibidores enzimáticos.

A este respecto, el número de las carbonilreductasas adecuadas en la biocatálisis y que se encuentran disponibles a buen precio en medida suficiente para aplicaciones a escala industrial es muy limitado. Se conocen las 10 siguientes carbonilreductasas S-específicas dependientes de NADH:

alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) (Enzyme Engineering, Vol 6, 1982, página 107).

Alcohol deshidrogenasa de levadura (YADH) (Alcohol dehydrogenases: The Enzymes, (1963) páginas 25-83. New York: Academic Press),

carbonilreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236), 15

carbonilreductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223) y Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), páginas 1721-1729),

alcohol deshidrogenasa de Candida boidinii (Biochim, Biophys. Acta 716, (1982), páginas 298-307) o

alcohol deshidrogenasa de Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), páginas 31-39).

Ninguna de las carbonilreductasas mencionadas ha encontrado hasta ahora aplicación a escala industrial. El 20 motivo principal de ello es, además de los espectros de sustratos con frecuencia demasiado estrechos o de la enantioselectividad reducida de las enzimas, sobre todo la disponibilidad de estas enzimas. Hasta ahora, la mayoría de las enzimas mencionadas no han podido ponerse a disposición en medida suficiente a precios favorables.

Un problema adicional en el caso de la aplicación de las carbonilreductasas mencionadas es la regeneración de los cofactores NADH o NADPH. Los procedimientos conocidos usan o bien regeneración de coenzimas acoplada a 25 sustratos, por ejemplo con 2-propanol, o bien regeneración de coenzimas acoplada a enzimas, por ejemplo con formiato deshidrogenasa.

Una desventaja de la regeneración de coenzimas acoplada a enzimas con formiato deshidrogenasa es su baja actividad específica (de 4 a 10 U/mg), por tanto la propia formiato deshidrogenasa recombinante es comparativamente cara (J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, páginas 187-193). 30

Una desventaja de la regeneración de coenzimas acoplada a sustratos con isopropanol es la posición del equilibrio desfavorable y la estabilidad enzimática insuficiente con respecto a los cosustratos usados tales como isopropanol.

El objetivo de la invención es proporcionar una oxidorreductasa que se caracterice por un amplio espectro de sustratos, alta enantioselectividad y por alta estabilidad frente a disolventes orgánicos. 35

Este objetivo se soluciona mediante una oxidorreductasa que en presencia de NADH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto, en la que más del 70% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 y presenta una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de ácido etil-4-cloro-3-oxobutírico para dar ácido (R)-etil-4-cloro-3-hidroxibutírico. 40

Se ha descubierto ahora que mediante una nueva oxidorreductasa pueden solventarse las desventajas mencionadas de los procedimientos del estado de la técnica.

La invención se refiere, de manera apropiada, a oxidorreductasas que pueden obtenerse a partir de levaduras de los géneros Pichia o Candida, particularmente a partir de Pichia capsulata.

En una configuración adicional la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que presenta la 45 secuencia de ADN según la SEQ ID NO:8 y a una oxidorreductasa que presenta la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:9. Estas secuencias se describen en el protocolo de secuencias adjunto.

Se prefiere una oxidorreductasa en la que del 80% al 99,5%, particularmente del 90% al 99,5%, especialmente del 99% al 99,5% de los aminoácidos sean idénticos a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9. La medición de

la actividad específica de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO:9 o de sus derivados o análogos definidos tal como sigue tiene lugar con el sistema de prueba que se describe en el ejemplo 1.

La invención se refiere además a la oxidorreductasa, que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:9 y que está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces mediante un polímero soluble en agua. Un polímero soluble en agua es por ejemplo polietilenglicol. La unión del polietilenglicol tiene lugar preferiblemente en el extremo N-5 terminal de la proteína según la SEQ ID NO:9. La oxidorreductasa según la SEQ ID NO:9 puede estar unida también a un cuerpo sólido tal como polietileno, poliestireno, polisacárido, celulosa o derivados de celulosa.

La invención se refiere también a una proteína de fusión caracterizada porque representa la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9, que está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxilo-terminal a través de un enlace peptídico. Las proteínas de fusión pueden, por ejemplo, separarse más 10 fácilmente de otras proteínas o se expresan en mayor medida en las células.

La invención se refiere también a un anticuerpo que se une de manera específica a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO:9. La producción de estos anticuerpos tiene lugar según métodos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados y posterior obtención de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. 15

La invención se refiere además a una secuencia de ADN aislada que codifica para la oxidorreductasa mencionada anteriormente, seleccionándose la secuencia de ADN del grupo que consiste en:

a) una secuencia de ADN que presenta la secuencia de nucleótidos según la SEQ ID NO:8 o su cadena complementaria, y

b) una secuencia de ADN que se hibrida con una secuencia de ADN según a), teniendo lugar la hibridación en 20 condiciones rigurosas.

Las condiciones para la hibridación se describen en Sambrok y Russel, Molecular Cloning a laboratory Manual, Vol 1, capítulo 1, protocolo 30-32.

La invención se refiere también a un vector de clonación, que contiene una o varias de las secuencias de ADN o de ácido nucleico mencionadas anteriormente. La invención se refiere también a un vector de expresión que se 25 encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y que contiene una o varias de las secuencias de ADN o de ácido nucleico mencionadas anteriormente, que están unidas de manera adecuada con una secuencia de control de la expresión. La invención se refiere también a una célula huésped que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión.

Las identidades de las secuencias de ADN o secuencia de aminoácidos mencionadas anteriormente se 30 calculan porque se suma el número de los aminoácidos o bases de ácido nucleico que son idénticos a las secuencias parciales de las respectivas proteínas o secuencias de ADN, y se divide la suma entre el número total de los aminoácidos o bases de ácido nucleico y se multiplica por cien.

Vectores de clonación adecuados son por ejemplo ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), vector de clonación pDrive (Quiagen, Hilden, Alemania), pS Blue, pET Blue, vectores pET LIC (Novagen, Madison, EE.UU.) así 35 como vectores de clonación TA-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

Vectores de expresión adecuados son por ejemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL o pTrx.

Secuencias de control de la expresión adecuadas son por ejemplo promotor trp-lac (tac), promotor trp-lac (trc), promotor lac, promotor T7 o promotor pL. 40

La oxidorreductasa de Pichia capsulata es un homotetrámero... [Seguir leyendo]

1. Oxidorreductasa, que en presencia de NADH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto, caracterizada porque más del 70% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 y presenta una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de ácido etil-4-cloro-3-oxobutírico para dar ácido (R)-etil-4-cloro-3-5 hidroxibutírico.

2. Oxidorreductasa según la reivindicación 1, caracterizada porque del 80% al 99,5%, particularmente del 90% al 99,5%, especialmente del 99% al 99,5% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9.

3. Oxidorreductasa según la reivindicación 2, caracterizada porque presenta la secuencia de ácido nucleico SEQ 10 ID NO:8 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9.

4. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 y está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces mediante un polímero soluble en agua.

5. Oxidorreductasa según la reivindicación 4, caracterizada porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol. 15

6. Oxidorreductasa según la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxilo-terminal a través de un enlace peptídico.

7. Anticuerpo, caracterizado porque se une de manera específica a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO:9.

8. Secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica para una oxidorreductasa según la reivindicación 1, 20 seleccionándose la secuencia de ácido nucleico del grupo que consiste en:

a) una secuencia de ácido nucleico que presenta la SEQ ID NO:8, o su cadena complementaria, y

b) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia según (a) en condiciones rigurosas.

9. Vector de clonación, caracterizado porque presenta una o varias de las secuencias de ácido nucleico o de ADN 25 según la reivindicación 8.

10. Vector de expresión, caracterizado porque contiene una o varias de las secuencias de ácido nucleico o de ADN según la reivindicación 8 y está unido de manera adecuada con una secuencia de control de la expresión.

11. Célula huésped que es célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión según la reivindicación 10. 30

12. Procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes (S)-hidroxicompuestos, caracterizado porque

a) un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua se reduce para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto y

b) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado. 35

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque como compuesto carbonílico se utiliza un compuesto de fórmula I

R1-C(O)-R2 (I)

con un resto R1 de

1) -alquilo (C1-C20), en el que alquilo es lineal o ramificado, 40

2) -alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es lineal o ramificado y opcionalmente contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,

4) -arilo (C6-C14), 45

5) -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6) -heterociclo (C5-C14), que no está sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7) -cicloalquilo (C3-C7);

en el que los restos R1 mencionados en 1) a 7) no están sustituidos o están mono, bi o trisustituidos, independientemente entre sí, con 5

a) -OH,

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

c) -NO2 o

d) -NH2 y

con un resto R2 de 10

1) -alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado,

2) -alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos o tres dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es lineal o ramificado y contiene opcionalmente uno o dos triples enlaces, o 15

4) -alquil (C0-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y no está sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro,

en el que los restos R2 mencionados en 1) a 4) no están sustituidos o están mono, bi o trisustituidos, independientemente entre sí con

a) -OH, 20

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

c) -NO2 o

d) -NH2.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las 25 reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

b) el NAD formado mediante la oxidorreductasa se reduce con un cosustrato para dar NADH y

c) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado.

15. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las 30 reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

b) el NAD formado mediante la oxidorreductasa se reduce con una deshidrogenasa y un cosustrato para dar NADH y

c) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado.

16. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque 35

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

b) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico y

c) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado.

17. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque 40

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

b) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico,

c) el NAD formado mediante la oxidorreductasa se reduce con un cosustrato para dar NADH, y

d) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado. 5

18. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NADH y agua para dar el correspondiente (S)-hidroxicompuesto,

b) el NAD formado mediante la oxidorreductasa se reduce con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADH, 10

c) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico y

d) se aísla el (S)-hidroxicompuesto quiral formado.

19. Procedimiento según la reivindicación 14, 15, 17 ó 18, caracterizado porque como cosustrato se utiliza etanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol.

20. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 18, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza la 15 levadura de panadería de Candida boidinii o Candida parapsilosis.

21. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 18, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza formiato deshidrogenasa dependiente de NADH y como cosustrato una sal del ácido fórmico tal como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

22. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 18, caracterizado porque como disolvente orgánico se utilizan dietil 20 éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter, dibutil éter, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.

23. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 18, caracterizado porque la fase orgánica asciende a del 5% al 80% del volumen de reacción total, preferiblemente del 10% al 40%.

24. Procedimiento para la obtención de (R)-hidroxicompuestos quirales de fórmula II,

R1-C(OH)-R2 (II) 25

con un resto R1 de

1) -alquilo (C1-C20), en el que alquilo es lineal o ramificado,

2) -alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es lineal o ramificado y opcionalmente contiene uno, dos, tres o 30 cuatro triples enlaces,

4) -arilo (C6-C14),

5) -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6) -heterociclo (C5-C14), que no está sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o 35

7) -cicloalquilo (C3-C7),

en el que los restos R1 mencionados en 1) a 7) no están sustituidos o están mono, bi o trisustituidos, independientemente entre sí, con

a) -OH,

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, 40

c) -NO2 o

d) -NH2 y

con un resto R2 de

1) -alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado,

2) -alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos o tres dobles enlaces,

3) -alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es lineal o ramificado y opcionalmente contiene uno o dos triples 5 enlaces, o

4) -alquil (C0-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y no está sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro,

en el que los restos R2 mencionados en 1) a 4) no están sustituidos o están mono, bi o trisustituidos, independientemente entre sí, con 10

a) -OH,

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

c) -NO2 o

d) -NH2,

caracterizado porque 15

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II, con la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NAD y agua y

b) se aísla el (R)-hidroxicompuesto quiral restante de fórmula II.

25. Procedimiento para la obtención de (R)-hidroxicompuestos quirales de fórmula II según la reivindicación 24, caracterizado porque 20

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II, con la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NAD y agua,

b) el NADH formado mediante la oxidorreductasa se oxida con un cosustrato para dar NAD y

c) se aísla el (R)-hidroxicompuesto quiral restante de fórmula II.

26. Procedimiento para la obtención de (R)-hidroxicompuestos quirales de fórmula II según la reivindicación 24, 25 caracterizado porque

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II, con la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NAD y agua,

b) el NADH formado mediante la oxidorreductasa se oxida con una deshidrogenasa y un cosustrato para dar NAD y 30

c) se aísla el (R)-hidroxicompuesto quiral restante de fórmula II.

27. Procedimiento para la obtención de (R)-hidroxicompuestos quirales de fórmula II según la reivindicación 24, caracterizado porque

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II con la oxidorreductasa según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NAD y agua, 35

b) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico y

c) se aísla el (R)-hidroxicompuesto quiral restante de fórmula II.

28. Procedimiento para la obtención de (R)-hidroxicompuestos quirales de fórmula II según la reivindicación 24, caracterizado porque

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II con la oxidorreductasa según 40 una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, NAD y agua,

b) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico,

c) el NADH formado mediante la oxidorreductasa se oxida con una deshidrogenasa y un cosustrato para dar NAD y

d) se aísla el (R)-hidroxicompuesto quiral restante de fórmula II.

29. Procedimiento según la reivindicación 25, 26 ó 28, caracterizado porque como cosustrato se utiliza acetona.