Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona por regeneración de cofactor en continuo.

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general Ien la que

R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4,

R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster,R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro,

el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C,

que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8,9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH oNADPH como cofactor,

caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración ≥10 g/l en el lote de reacción y porque elcofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona por regeneración de cofactor en continuo

La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de 5 secodiona de fórmula general I, en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor.

La producción industrial de hormonas esteroideas se realiza de dos modos independientes entre sí, a saber, por un lado a partir de compuestos esteroideos de origen natural de fuentes vegetales y por otro lado de forma totalmente sintética mediante síntesis enantioselectiva a partir de precursores proquirales. De estos dos modos, la síntesis total de

esteroides se está volviendo cada vez más importante, sobre todo porque esta permite también la introducción de elementos estructurales que no están incluidos en esteroides de origen natural.

Los componentes clave de la síntesis total de esteroides enantioméricamente puros son a este respecto compuestos de fórmula general I que se designan también como secoesteroides, 8, 14-seco-gona-tetraen-14, 17-dionas o secodionas. Son representantes especiales de este grupo, por ejemplo, los compuestos metilsecodiona (fórmula II, 13-metil-3

metoxi-8, 14-seco-gona-1, 3, 5 (10) , 9 (11) -tetraen-14, 17-diona) y etilsecodiona (fórmula III, 13-etil-3-metoxi-8, 14-secogona-1, 3, 5 (10) , 9 (11) -tetraen-14, 17-diona) , a partir de los cuales pueden prepararse, por ejemplo, los compuestos farmacológicamente activos etinilestradiol (fórmula IV) y norgestrel (fórmula V) .

Fórmula II Fórmula III

Fórmula IVI Fórmula V

La etapa clave en la producción de compuestos esteroideos enantioméricamente puros es a este respecto la transformación del compuesto de fórmula I (por ejemplo, II y III) en un compuesto ópticamente activo con C-13 asimétrico preformado mediante reducción enantioselectiva de uno de los grupos cetona hasta grupos hidroxilo. Los

compuestos hidroxisecoesteroideos ópticamente activos resultantes (secoles, fórmulas VI a IX) pueden procesarse a continuación mediante ciclación con mantenimiento de la quiralidad hasta compuestos esteroideos quirales.

Mediante la reducción enantioselectiva de un grupo cetona del compuesto de fórmula I pueden formarse teóricamente cuatro compuestos ópticamente activos (fórmulas VI a IX) .

Son de especial interés económico a este respecto los compuestos de fórmula VI en los que el grupo hidroxilo en la posición 17 presenta la configuración beta, ya que estos conducen a derivados de estrona natural. Dichos compuestos se designan también como 17-beta-hidroxisecoesteroides.

La reducción estereoselectiva de los derivados de secodiona de fórmula general I con la ayuda de distintos microorganismos se estudió con especial intensidad en los años 60 y 70 del siglo XX. A este respecto, pudo mostrarse que distintas cepas de levadura del género Candida, Debar y omyces, Kloeckera, Pichia, Cr y ptococcus, Rhodotorula, Torulopsis y Hansenula son capaces de reducir secodionas hasta distintos compuestos hidroxilados (documentos US 3616226, US 1252524, US 3616225) .

Particularmente las levaduras del género Saccharomyces, como por ejemplo, S. uvarum, pueden utilizarse ventajosamente para producir, por ejemplo, los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967) ) . Otras cepas de levadura como, por ejemplo Saccharomyces drosophilarum, reducen la secodiona preferiblemente hasta el correspondiente 14-alfa-hidroxisecoesteroide (Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 22, 463-471 (1975) ) . Se describe además la formación de 14-alfa-hidroxisecoesteroide mediante la reducción de secodiona por Bacillus thuringiensis (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967) ) .

Los principios activos gestagénicos y estrogénicos encuentran una amplia aplicación en el mundo como anticonceptivos y en terapia de sustitución hormonal. Hasta ahora, la mayoría de síntesis de derivados estrogénicos y gestagénicos están constituidas por el principio de reacción anteriormente descrito, cuya etapa clave produce la reducción enantioselectiva de secodionas hasta los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides.

La reducción estereoselectiva de los derivados de secodiona se lleva a cabo a este respecto hasta ahora como una biotransformación en célula entera mediante distintas cepas de levadura del género Pichia o Saccharomyces. Estos procedimientos poseen sin embargo la desventaja de que son practicables solo a muy bajas concentraciones de sustrato bastante por debajo del 1% (generalmente de 1 a 5 g/l) (documento US 3697379; Current Science, 5 de feb. (1984) , vol. 53, nº 3, página 124; Indian Journal of Experimental Biology, vol. 27, agosto de 1989, páginas 742-743) . Así, resulta ser muy costoso particularmente el procesamiento y aislamiento del producto de reacción a partir de grandes volúmenes, así como la separación de grandes cantidades de biomasa.

Szentirmai et al. (Acta Microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae, vol. 22, nº 4, 1975, pág. 463-470) describen un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona, en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor. En este procedimiento, se utiliza el derivado de secodiona a una concentración de únicamente 1 g/l en el lote de reacción.

Al entender del inventor, no se han aislado, identificado ni descrito hasta ahora las enzimas participantes en la reducción. Igualmente, no se han identificado todavía secuencias de ADN que codifiquen oxidorreductasas con las que pueda conseguirse la reducción de derivados de secodiona.

La invención tiene por tanto el objetivo de procurar un procedimiento con el que puedan reducirse enantioselectivamente derivados de secodiona de fórmula general I, particularmente aquellos de fórmula II y III. Entre otros, debe ser posible en este sentido la preparación de los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides.

En un primer aspecto, se consigue este objetivo según la invención mediante un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general I,

en la que

R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4, R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster, R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,

reduciéndose el derivado de secodiona con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor,

caracterizándose dicho procedimiento porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración ≥10 g/l en el lote de reacción y porque el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente.

Este procedimiento representa una mejora esencial de la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona frente al estado de la técnica. El procedimiento según la invención posibilita la reducción de derivados de secodiona hasta los distintos hidroxisecoesteroideos correspondientes con enzimas libres en intervalos de concentración que superan con mucho los descritos en el estado de la técnica.

Una forma de realización preferida del procedimiento según la invención se caracteriza porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa

a) presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos un 50% de los aminoácidos son idénticos a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 5,

b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 o

c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general I

en la que R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4, R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster, R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C,

que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,

en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor,

caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración ≥10 g/l en el lote de reacción y porque el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa

a) presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos un 50% de los aminoácidos son idénticos a cualquiera de las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 20 5,

b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 o

c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con las SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa presenta una longitud de 230 a 260 aminoácidos y comprende una o varias de las secuencias parciales seleccionadas del grupo compuesto las secuencias de SEQ ID NO:18 a SEQ ID NO:42:

nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig,

gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv,

fkgaplpa, fkaaplpa, fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag, spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal, avysask, avysatk, pikgwi y pisgwi.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cofactor oxidado NAD o NADP se regenera mediante la oxidación de un alcohol.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se usa un alcohol secundario de fórmula general RxRyCHOH en la que Rx yRy son independientemente entre sí un grupo alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotales ≥ 3.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se usa un alcohol del grupo que consiste en 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 5-metil2-hexanol, ciclohexanol o 2-octanol.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se añade adicionalmente una oxidorreductasa/deshidrogenasa.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el TTN, es decir el número de recambio total = mol de derivado de secodiona reducida/ml de cofactor utilizado, es ≥103.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se lleva a cabo en un sistema bifásico acuoso-orgánico.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se utiliza adicionalmente un disolvente orgánico, preferiblemente dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o mezclas de los mismos.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se utiliza como disolvente orgánico dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o una mezcla de los mismos.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 10 g/l a 500 g/l, referida al volumen total, preferiblemente de 25 g/l a 300 g/l, con especial preferencia de 50 g/l a 200 g/l, en el lote de reacción.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 25 g/l a 300 g/l, referida al volumen total, en el lote de reacción.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 50 g/l a 200 g/l, referida al volumen total, en el lote de reacción.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se utiliza como derivado de secodiona 13-etil-3-metoxi-8, 14-seco-gona-1, 3, 5 (10) , 9 (11) -tetraen-14, 17-diona, es decir, etilsecodiona-fórmula III.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se utiliza como derivado de secodiona 13-metil-3-metoxi-8, 14-seco-gona-1, 3, 5 (10) , 9 (11) -tetraen-14, 17-diona, es decir, metilsecodiona-fórmula II.