Procedimiento para la preparación de derivados de esteroides mediante la reducción de compuestos oxoesteroides o mediante la oxidación de compuestos hidroxiesteroides usando una hidroxiesteroide deshidrogenasa.

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos oxoesteroides de la fórmula general Ien la que **Fórmula**

R1 representa hidrógeno,

un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R2 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R3 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un grupo metilo,

R4 representa hidrógeno o un grupo hidroxilo,

R5 representa hidrógeno, un resto -COR10, en el que R10 es un grupo alquilo C1-C4 sustituido con un grupo hidroxiloo no sustitudio, o un grupo carboxialquilo C1-C4 sustituido o no sustituido,

o R4 y R5 representan conjuntamente un grupo oxo,

R6 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R7 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R8 representa hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, y

R9 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un haluro,

siendo al menos uno de R1, R2, R4 + R5, R6, R8 o R9 un grupo oxo o R5 es un resto -COR10 y el elemento estructural

Procedimiento para la preparación de derivados de esteroides mediante la reducción de compuestos oxoesteroides

o mediante la oxidación de compuestos hidroxiesteroides usando una hidroxiesteroide deshidrogenasa

La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos 5 oxoesteroides, reduciéndose el compuesto oxoesteroide con una hidroxiesteroide deshidrogenasa en presencia de un cofactor NADH o NADPH.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para la oxidación enzimática de compuestos hidroxiesteroides, oxidándose el compuesto hidroxiesteroide con una hidroxiesteroide deshidrogenasa en presencia de un cofactor NAD o NADP.

Los esteroides son compuestos que poseen el sistema anular de la colesterina y que se diferencian en el número de enlaces dobles, el tipo, número y posición de grupos funcionales, número de grupos metilo, las cadenas de alquilo laterales y la configuración de los enlaces.

Los compuestos esteroides están presentes tanto en organismos animales como también en hongos y en plantas y presentan una variada actividad biológica, por ejemplo como hormonas sexuales masculinas y femeninas, como

hormonas de las glándulas suprarrenales, como vitaminas, como ácidos biliares, como esteroide sapogeninas, como sustancias cardioactivas y como venenos de sapos.

Por compuestos oxoesteroides se entiende en adelante esteroides del tipo definido al principio, es decir, los que presentan al menos una función cetona, pudiendo ésta estar presente en el sistema anular o también en una cadena lateral situada en el esqueleto del esteroide.

Por compuestos hidroxiesteroides se entiende en adelante esteroides del tipo definido al principio, es decir, los que presentan al menos una función hidroxilo, pudiendo ésta estar presente en el sistema anular o también en una cadena lateral situada en el esqueleto del esteroide.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos oxoesteroides de la fórmula general I

en la que R1 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R2 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R3 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un grupo metilo,

R4 representa hidrógeno o un grupo hidroxilo, R5 representa hidrógeno, un resto -COR10, en el que R10 es un grupo alquilo C1-C4 no sustituido o sustituido con un grupo hidroxilo, o un grupo carboxialquilo C1-C4 sustituido o no sustituido,

o R4 y R5 representan conjuntamente un grupo oxo,

R6 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R7 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R8 representa hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, y R9 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un haluro,

siendo al menos uno de R1, R2, R4 + R5, R6, R8 o R9 un grupo oxo o R5 un resto -COR10 y el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 enlaces dobles C-C,

o la fórmula II (ácido cetolitocólico)

La presente invención se refiere también a un procedimiento para la oxidación enzimática de compuestos hidroxiesteroides de la fórmula general I o de los que son derivados de los ácidos biliares tales como ácido cólico, ácido quenodeoxicólico, ácido 12-oxocólico, ácido 3-hidroxi-12-oxocólico, ácido cetolitocólico o ácido litocólico, oxidándose el compuesto hidroxiesteroide con una hidroxiesteroide deshidrogenasa en presencia de un cofactor

NAD o NADP.

Debido a las variadas actividades fisiológicas de los esteroides es evidente que los compuestos y derivados esteroides se usan también en medicina en un gran número como sustancias terapéuticamente activas y medicamentos.

De este modo, por ejemplo, se usan ampliamente a escala mundial derivados de gestágeno y de estrógeno como

anticonceptivos; los andrógenos (testosterona) se usan como anabólicos y antiandrógenos, por ejemplo en la terapia de carcinoma de próstata. Los glucocorticoides (cortisona, cortisol, prednisolona y prednisona) y sus derivados, debido a su actividad antiflogística, antialérgica e inmunosupresora, se usan ampliamente en el tratamiento terapéutico de enfermedades de la piel, enfermedades reumáticas, reacciones alérgicas, enfermedades renales, enfermedades gastrointestinales y muchos otros trastornos.

El mercado mundial de compuestos esteroides biológicamente activos es inmenso. En la producción de distintos derivados esteroides con diferentes actividades, las biotransformaciones tienen un papel grande. A este respecto son de importancia las reacciones particulares que están catalizadas por hidroxilasas y por deshidrogenasas. Tienen un papel particular, a este respecto, la deshidrogenación 1-delta, la reducción 11-beta, la reducción 20-beta, la reducción 17-beta, las reducciones estereoselectivas en la posición 3 y 7, pero también las oxidaciones de grupos

hidroxilo, en particular en las posiciones 3, 7, 12 y 17.

Industrialmente se han realizado hasta la fecha biorreducciones de esteroides exclusivamente con células completas intactas y en concentraciones de sustrato muy inferiores a 10 g/l. Esto es debido, por una parte, a que las enzimas responsables de las biotransformaciones, hasta la fecha, ni se han caracterizado ni son expresables y, por otra parte, también a que no se ha propuesto ninguna solución tecnológica satisfactoria que solucione, por una parte, el

problema de la reducida solubilidad de los esteroides en medio acuoso y, por otra parte, el problema de la regeneración de los cofactores NADH y NADPH en una medida suficiente.

Hasta la fecha se han realizado oxidaciones de esteroides a escala industrial químicamente.

De 1975 a 1988 se han descrito enayos de reducción enantioselectiva de esteroides con enzimas aisladas, esencialmente por G. Carrea (Eur. J. Biochemistr y 44, 1974 p. 401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol 17,

1975, p. 1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol 6, julio, 1984, p. 307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, 1984, p. 560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p. 2902-2906; J. Org. Chem. 58, 1993, p. 499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p. 88-92; Enzyme Microb. Technol., Vol 10, junio, p. 333-339; Archives of Biochemistr y and Biophysics, 159, 1973, p. 7-10) .

A este respecto se usaron distintas hidroxiesteroide deshidrogenasas (HSHD) , lográndose la regeneración del

cofactor NADH esencialmente mediante el acoplamiento con las enzimas lactato deshidrogenasa, formiato deshidrogenasa o también alcohol deshidrogenasa de levadura. La regeneración de NADP se realizó usando

glucosa deshidrogenasa. Para superar los problemas de solubilidad se llevaron a cabo ensayos en un sistema bifásico con acetato de etilo y acetato de butilo como fase orgánica. También con enzimas aisladas en el sistema bifásico se trabajó, a este respecto, en intervalos de concentraciones que eran muy inferiores a 10 g/l, siendo los "números de recambio totales" (NRT = moles de compuesto oxoesteroide reducido / moles de cofactor usado)

también muy inferiores a 1000, por lo que estos procesos no representan ninguna ventaja económica en comparación con procedimientos de célula completa.

Además existen trabajos en los que se lleva a cabo la conversión de grupos hidroxilo de 7 alfa a 7 beta mediante acoplamiento de oxidación y reducción. Esto se logró mediante acoplamiento de 7α HSDH y 7β HSDH (Pedrini y col., Steroids 71 (2006) p 189-198) . También en estos procedimientos se trabajó en intervalos de concentraciones

muy inferiores a 10 g/l y los "números de recambio totales" (NRT = moles de compuesto oxoesteroide reducido / moles de cofactor usado) logrados fueron inferiores a 100, por lo que estos procesos tampoco son ecónomicamente relevantes.

La invención tiene por objeto evitar estas desventajas y dificultades y tiene el objetivo de proporcionar un procedimiento que posibilite... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de compuestos oxoesteroides de la fórmula general I

en la que

R1 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R2 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo,

R3 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un grupo metilo,

R4 representa hidrógeno o un grupo hidroxilo,

R5 representa hidrógeno, un resto -COR10, en el que R10 es un grupo alquilo C1-C4 sustituido con un grupo hidroxilo

o no sustitudio, o un grupo carboxialquilo C1-C4 sustituido o no sustituido,

o R4 y R5 representan conjuntamente un grupo oxo, R6 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R7 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R8 representa hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, y

R9 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un haluro,

siendo al menos uno de R1, R2, R4 + R5, R6, R8 o R9 un grupo oxo o R5 es un resto -COR10 y el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 enlaces dobles C-C,

o la fórmula II (ácido cetolitocólico)

en el que el compuesto oxoesteroide se reduce con una hidroxiesteroide deshidrogenasa en presencia de un cofactor NADH o NADPH, caracterizado porque

a) el compuesto oxoesteroide está presente en la preparación de reacción en una concentración ≥ 50 g/l,

b) el cofactor NAD o NADP oxidado formado mediante la hidroxiesteroide deshidrogenasa se regenera 25 continuamente mediante la oxidación de un alcohol secundario de la fórmula general RXRYCHOH, en la que RX, RY

independientemente uno de otro representan alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotal ≥ 3, o mediante la oxidación de un cicloalcanol C4-C6, y

c) para la oxidación del alcohol secundario de la fórmula general RXRYCHOH o del cicloalcanol se usa una oxidorreductasa / alcohol deshidrogenasa adicional.

5 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como alcohol secundario de la fórmula general RXRYCHOH se usa 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 5-metil-2-hexanol o 2-octanol y como cicloalcohol se usa ciclohexanol.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se lleva a cabo en un sistema bifásico orgánico acuoso.

10 4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se usa adicionalmente un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el NRT, es decir número de recambio total = moles de compuesto oxoesteroide reducidos / moles de cofactor usados es ≥ 103.

15 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se reduce al menos el 50 % del compuesto oxoesteroide usado dentro de un periodo de 2 a 96 h dando el compuesto hidroxiesteroide.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa dexametasona (fórmula Ill) .

20 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa 4-androsten-3, 17-diona (fórmula IV) .

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa 1, 4-androstadien-3, 17-diona (fórmula V) .

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa estrona (fórmula VI) .

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa pregnenolona (fórmula VII) .

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como compuesto oxoesteroide se usa cortisona (fórmula VIII) .

13. Procedimiento para la oxidación enzimática de compuestos hidroxiesteroides de la fórmula general I

en la que R1 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo o un grupo oxo, R2 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo oxo o un grupo hidroxilo,

R3 representa hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un grupo metilo, R4 representa hidrógeno o un grupo hidroxilo, R5 representa hidrógeno, un resto -COR10, en el que R10 es un grupo alquilo C1-C4 sustituido con un grupo hidroxilo

o no sustituido, o un grupo carboxialquilo C1-C4 sustituido o no sustituido,

o R4 y R5 representan conjuntamente un grupo oxo, R6 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo oxo o un grupo hidroxilo, R7 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo oxo o un grupo hidroxilo, R8 representa hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, y

R9 representa hidrógeno, un grupo metilo, un grupo hidroxilo, un grupo oxo o un haluro, 10 siendo al menos uno de R1, R2, R4, R6, R7, R8 o R9 un grupo hidroxilo y el elemento estructural

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 enlaces dobles C-C,

o de los derivados de ácido biliar ácido cólico, ácido quenodeoxicólico, ácido 12-oxocólico, ácido 3-hidroxi-12ºxocólico, ácido cetolitocólico o ácido litocólico,

oxidándose el compuesto hidroxiesteroide con una hidroxiesteroide deshidrogenasa en presencia de un cofactor NAD o NADP, caracterizado porque

a) el compuesto hidroxiesteroide está presente en la preparación de reacción en una concentración ≥ 50 g/l,

b) el cofactor NADH o NADPH reducido formado mediante la hidroxiesteroide deshidrogenasa se regenera continuamente mediante la reducción de un compuesto cetona de la fórmula general RXRYCO, en la que RX, RY 20 independientemente uno de otro representan alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotal ≥ 3, o mediante la reducción de una cicloalcanona C4-C6, y

c) para la reducción del compuesto cetona de la fórmula general RXRYCO o de la cicloalcanona se usa una oxidorreductasa / alcohol deshidrogenasa adicional.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque como cetona de la fórmula general RXRYCO se

usa acetona, 2-butanona, 2-pentanona, 4-metil-2-pentanona, 2-hexanona, 2-heptanona, 5-metil-2-hexanona o 2ºctanona y como cicloalcanona se usa ciclohexanona.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque se lleva a cabo en un sistema bifásico orgánico acuoso.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque se usa adicionalmente un disolvente orgánico tal

como, por ejemplo, dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.

17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el NRT, es decir número de recambio total = moles de compuesto hidroxiesteroide oxidados / moles de cofactor usados es ≥ 103.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque se oxida al menos el 50 % del 35 compuesto hidroxiesteroide usado, dentro de un periodo de 2 a 96 h, dando el compuesto oxoesteroide.