OXIDORREDUCTASA DE METSCHNIKOWIA ZOBELLII.

Oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral,

caracterizada porque más del 70% de sus aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta una actividad específica superior a 1 μmol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4- fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2- hidroxi-4-fenil-butírico

La presente invención se refiere a una nueva oxidorreductasa dependiente de NADPH de levaduras, por ejemplo del género Metschnikowia, especialmente de Metschnikowia

enzimático para la obtención enantioselectiva de hidroxicompuestos en el sistema de dos fases con el uso de la oxidorreductasa sobreexpresada recombinante aislada a partir de Metschnikowia zobellii.

Los hidroxicompuestos ópticamente activos son elementos estructurales quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente activos, sustancias aromáticas, feromonas, productos agroquímicos o inhibidores enzimáticos.

A este respecto, se encuentra muy limitado el número de carbonilrreductasas disponibles a buen precio en suficiente medida y adecuadas para aplicaciones a escala industrial en la biocatálisis. En el caso de las alcoholdeshidrogenasas que podían utilizarse hasta ahora en forma de enzimas aisladas, se trata en gran parte de alcoholdeshidrogenasas secundarias, cuyo espectro de sustratos se limita a sustratos con una cadena lateral grande y una pequeña en las proximidades de la función carbonilo, pudiendo ascender la longitud máxima de la cadena más pequeña de las dos cadenas laterales a tres átomos de C.

Tales enzimas son por ejemplo alcoholdeshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) (Enzyme Engineering, vol. 6, 1982, página 107).

Alcoholdeshidrogenasa de levadura (YADH) (Alcohol dehydrogenases: The Enzymes, (1963) páginas 25-83. New York: Academic Press), carbonilrreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236) o ADH de Pichia capsulata (documento DE10327454.4). Carbonilrreductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223) y

Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), páginas 1721-1729), alcoholdeshidrogenasa de Candida boidinii (Biochim,. Biophys. Acta 716, (1982), páginas 298-307) o alcoholdeshidrogenasa de Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), páginas 31-39).

Alcoholdeshidrogenasas secundarias R-específicas de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335), Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1), Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833).

Además, se usan también enzimas de los organismos Candida magnoliae (documento WO 98/35025), Kluyveromyces lactis (documento JP-A Hei 11-187869) y Sporobolomyces salmonicolor (FEMS Microbiology Letters 70 (1990) 45-48) para la cetorreducción. En el caso de estas enzimas se trataba de homólogos con respecto a la subunidad del complejo de ácido graso sintasa cuya aplicación permanecía limitada hasta ahora a la reducción de 4-cloroacetoacetato.

Hasta ahora, pocas de las carbonilrreductasas mencionadas han encontrado aplicación a escala industrial. El motivo principal para ello es, además de los espectros de sustratos con frecuencia demasiado estrechos o de la enantioselectividad reducida de las enzimas, sobre todo la disponibilidad de estas enzimas. La mayoría de las enzimas mencionadas no podían proporcionarse hasta ahora de manera recombinante en suficiente medida a buenos precios.

Ahora se encontró que mediante una nueva oxidorreductasa pueden solventarse las desventajas mencionadas de los procedimientos del estado de la técnica. En el caso de la oxidorreductasa según la invención se trata de una oxidorreductasa novedosa que no presenta ninguna semejanza ni homología con las carbonilrreductasas ya conocidas.

El documento EP 0 918 090 A describe una carbonilrreductasa, que se obtiene a partir de Zygosaccharomyces rouxii y reduce sustratos cetónicos en presencia de NADPH y agua de manera enantioselectiva para dar los correspondientes hidroxicompuestos.

Asimismo, Costello C.A. et al. (Eur. J. Biochem. 267, 2000: 5493-5501) describen una cetorreductasa aislada a partir de Zygosaccharomyces rouxii, que cataliza la reducción asimétrica de determinados sustratos cetónicos con NADPH como coenzima.

A este respecto, la estereoselectividad de la oxidorreductasa según la invención no se determina sólo mediante el tamaño de las cadenas laterales que flanquean al grupo carbonilo, sino también mediante su hidrofobicidad. De esta manera, el espectro de sustratos y la enantioselectividad de la oxidorreductasa según la invención se diferencian claramente de las clases de enzimas conocidas.

La oxidorreductasa según la invención se caracteriza porque en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales y más del 70% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y presenta una actividad específica

superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Puede obtenerse por ejemplo a partir de levaduras del género Metschnikowia, especialmente a partir de Metschnikowia zobellii.

Preferiblemente es una oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii, que presenta la secuencia de ADN según la SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 13, tal como se describe en el protocolo de secuencias adjunto.

Preferiblemente es una oxidorreductasa, en la que del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. La medición de la actividad específica de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13 o sus análogos o derivados definidos como a continuación tiene lugar con el sistema de prueba que se describe en el ejemplo 1.

También son adecuadas oxidorreductasas, que presentan de 1 a 40 aminoácidos adicionalmente a o de 1 a 40 aminoácidos menos que la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID

NO: 13 y que muestra una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Se prefieren las oxidorreductasas, en las que hay de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 3 a 10 aminoácidos más o menos en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

Puede usarse también una oxidorreductasa que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y está derivatizada una, dos, tres, cuatro o cinco veces mediante un polímero soluble en agua y que presenta una actividad específica superior

a1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Un polímero soluble en agua es por ejemplo polietilenglicol. La unión del polietilenglicol tiene lugar preferiblemente en el extremo N terminal de la proteína según la SEQ ID NO: 13. La oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13 puede estar unida también a un componente sólido, preferiblemente de polietileno, poliestireno, polisacárido, celulosa o un derivado de celulosa.

La invención se refiere además a fragmentos de proteína de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 con de 5 a 30 aminoácidos cada fragmento. Se prefieren fragmentos de la SEQ ID NO: 13 con una longitud de cadena de desde 6 hasta 25 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 10 a 18 aminoácidos. Estos fragmentos pueden utilizarse por ejemplo para encontrar la oxidorreductasa según la invención de Metschnikowia zobellii o de cualquier otro microorganismo.

La invención se refiere además a una proteína de fusión, que comprende la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma con de 5 a 30 aminoácidos, que está unida de manera peptídica con un polipéptido adicional en el extremo N terminal o carboxilo terminal. Las proteínas de fusión pueden separarse por ejemplo

más fácilmente de otras proteínas o se expresan en una mayor medida en las células.

La invención se refiere además a anticuerpos que se unen de manera específica a la oxidorreductasa según...

1. Oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, caracterizada porque más del 70% de sus aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta una actividad

específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2hidroxi-4-fenil-butírico.

2. Oxidorreductasa según la reivindicación 1, caracterizada porque del 80 al 99,5%, preferiblemente del 90 al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99 al 99,5% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

3. Oxidorreductasa según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y se codifica por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12.

4. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque puede obtenerse a partir de levaduras del género Metschnikowia, especialmente a partir de Metschnikowia zobellii.

5. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta de 1 a 40 aminoácidos adicionalmente a o de 1 a 40 aminoácidos menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta

una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico.

6. Oxidorreductasa según la reivindicación 5, caracterizada porque presenta de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 3 a 10 aminoácidos, más o menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

7. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua y muestra una

actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2ºxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)2-hidroxi-4-fenil-butírico.

8. Oxidorreductasa según la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol.

9. Anticuerpo, caracterizado porque se une de manera específica a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13.

10. Secuencia de ADN, que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13.

11. Secuencia de ADN, que codifica para una oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua cataliza la reducción de un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, en la que la secuencia de ADN a)

corresponde a la SEQ ID NO: 12 o su cadena complementaria o b) es una secuencia de ADN, que hibrida con la secuencia de ADN según a) o su cadena complementaria, teniendo lugar la hibridación en condiciones rigurosas, o c) es una secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código genético codifica para una proteína, tal como se codifica también por una secuencia de ADN según a) o b).

12. Secuencia de ADN, caracterizada porque en ella más del 70% de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12 o su cadena complementaria y porque codifica para una oxidorreductasa, que presenta

una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico.

13. Secuencia de ADN según la reivindicación 12, caracterizada porque del 80% al 99,5%, preferiblemente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5%, de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12.

14. Vector de clonación, caracterizado porque comprende una o varias de las secuencias de ADN según una de las reivindicaciones 10 a 13.

15. Vector de expresión, caracterizado porque comprende una o varias de las secuencias de ADN según una de las reivindicaciones 10 a 13 y está unido a una secuencia de control de la expresión.

16. Célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o vegetal, y que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, y b) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque como compuesto carbonílico se utiliza un compuesto de fórmula I,

R1-C(O)-R2 (I) en la que R1 significa 1) alquilo (C1-C20), que es de cadena lineal o ramificado, 2) alquenilo (C2-C20), que es de cadena lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), que es de cadena lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14),

5) alquil(C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido de una a tres veces, preferiblemente con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o 7) cicloalquilo (C3-C7),

estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o estando sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2, y

R2 significa 1) alquilo (C1-C6), que es de cadena de cadena lineal o ramificado,

2) alquenilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno, dos o tres dobles enlaces,

3) alquinilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno o dos triples enlaces, o

4) alquil(C0-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), siendo alquilo lineal o ramificado y estando no sustituido o sustituido de una a tres veces, preferiblemente con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 4) no sustituidos o sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2.

19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8,

NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con un cosustrato para dar NADPH, y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

20. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato para dar NADPH, y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

21. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

22. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico, c) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con un cosustrato para dar NADPH, y d) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

23. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADPH, c) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico y d) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

24. Procedimiento según la reivindicación 19, 20, 22 ó 23, caracterizado porque como cosustrato se usa 2-propanol, 2butanol, 2-pentanol o 2-octanol.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizado porque éster etílico del ácido 2-oxo-4fenil-butírico se transforma en éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico, éster etílico del ácido 8cloro-6-oxo-octanoico se transforma en éster etílico del ácido (R)-8-cloro-6-hidroxi-octanoico, 2-cloro-1-feniletan-1-ona se transforma en (1R)-2-cloro-1-fenil-etan-1-ol

o glioxilato de etilfenilo se transforma en (1R)-mandelato de etilo.

26. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 23, caracterizado porque se utiliza una deshidrogenasa de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis.

27. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 23, caracterizado porque se utilizan como deshidrogenasa formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH y como cosustrato una sal del ácido fórmico tal como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

28. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque como disolvente orgánico se utilizan terc-butilmetil éter, diisopropil éter, heptano, hexano o ciclohexano o sus mezclas.

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el disolvente orgánico forma una

48 fase, cuyo porcentaje asciende a del 5 al 80%, preferiblemente del 10 al 40%, con respecto al volumen de reacción total.