OXIDORREDUCTASA.

Oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido,

caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo

La presente invención se refiere a una oxidorreductasa, a una secuencia de ADN aislada de la oxidorreductasa, a 5 una proteína de fusión basada en la oxidorreductasa y a un procedimiento para la obtención enantioselectiva de ésteres de S-2-hidroxiácido.

Los 2-hidroxiácidos y sus ésteres representan unidades estructurales básicas de síntesis quirales importantes a partir de los cuales pueden obtenerse una serie de compuestos obteniendo la quiralidad en el átomo C2, por ejemplo epóxidos, ésteres alquílicos, ésteres hidracinílicos, alfa-N-alcoxiaminoésteres o alfa-aminoésteres. 10

Hasta la fecha numerosos trabajos de investigación se han dedicado al desarrollo de métodos para preparar 2-hidroxiácidos enantioméricamente puros y sus ésteres, habiéndose considerado diferentes planteamientos químicos y biocatalíticos. Hasta la fecha aún no se ha logrado desarrollar procedimientos que satisfagan los requisitos de producción a nivel industrial. Especialmente en la producción de 2-hidroxiácidos y sus ésteres parece ser superior la introducción catalizada por enzimas del centro quiral de la síntesis mediante catalizadores químicos. 15

En el caso de los procedimientos catalizados por enzimas existen momentáneamente tres procedimientos diferentes. Una manera es la síntesis catalizada por oxinitrilasa de cianohidrinas quirales y su posterior hidrólisis, a menudo también catalizada por enzimas (Biotransformations in Organic Chemistry, A Textbook. 4ª edición, Springer (2000), K. Faber; Cyanhydrinformation). El inconveniente de este procedimiento es el uso del HCN tóxico.

Un procedimiento adicional es la resolución de racematos de ésteres de 2-hidroxiácido con ayuda de lipasas, por 20 ejemplo de Pseudomonas fluorescens (J. Org. Chem. 55, 812-815 (1991), Kinetic Resolution of 2-substituted Esters catalysed by a Lipase Ex. Pseudomonas fluorescens, Kalaritis, P. et al.). El inconveniente de este método es el rendimiento teórico de tan sólo el 50%.

Un procedimiento adicional es la síntesis de 2-hidroxiácidos quirales y sus ésteres mediante la reducción de 2-oxoácidos proquirales o sus ésteres. Se conocen las transformaciones con células de levadura completas o 25 células de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis o procedimientos con enzimas aisladas. En el caso de las transformaciones con células de levadura completas se atribuyó la actividad enzimática reductora en los 2-oxoácidos a las enzimas lactato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa (Ramesh N. Patel Stereoselective Biocatalyse, NY (2000), 14. Stereoselective Synthesis of Chiral Compounds Using Whole-Cell Biocatalysis, Paola D'Arrigo, Giuseppe Pedrocchi-Fantoni y Stefano Servi), mientras que en las reducciones realizadas con Proteus se cree que es 30 responsable de la reacción una proteína hierro-azufre dependiente de molibdeno de membrana (Eur J Biochem (1994); 222(3):1025-32, The (2R)-hydroxycarboxylate-viologen-oxidoreductase from Proteus vulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein, Trautwein T, Krauss F, Lottspeich F, Simon H.).

En procedimientos conocidos para la reducción de ésteres de 2-oxoácido se utilizan las enzimas aisladas (D/L)-lactato deshidrogenasa (documento US 5.686.275), (D/L)-dihidroxiisocaproato deshidrogenasa (documento US 35 6.033.882) o D-mandelato deshidrogenasa (Appl Environ Microbiol 2002 Feb; 68(2):947-51, Two forms of NAD-dependent D-mandelate dehydrogenase in Enterococcus faecalis IAM 10071. Tamura Y. et al 10), que también pueden clonarse, sobreexpresarse y obtenerse comercialmente. Estas enzimas son dependientes de NADH y no transforman los ésteres de 2-oxoácido. Además se conoce que las enzimas que reducen los 2-oxoácidos o sus ésteres, no transforman alcoholes secundarios. 40

Además se conocen procedimientos, en los que la coenzima NAD se regenera con formiato deshidrogenasa, por ejemplo a partir de Candida boidinii o también de manera recombinante a partir de Pseudomonas fluorescens (Biotechnology, Biotransformations I (Rehm y Reed) 9. Alcohol Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions J. Peters, WILEY-VCH-Verlag, (1998)). A modo de ejemplo se menciona en este caso el procedimiento para la producción enzimática de ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico con ayuda de D-lactato deshidrogenasa de 45 Staphylococcus epidermidis (Industrial Biotransformations, Liese, K. Seelbach, C.Wandrey, WILEY-VCH-Verlag, (2000)). El inconveniente de la regeneración de coenzima con formiato deshidrogenasa es la reducida actividad específica de la formiato deshidrogenasa (de 4 a 10 U/mg) y los elevados costes para la producción de la enzima. Por esto, desde el punto de vista económico, es necesario usar la enzima varias veces, lo que da como resultado un control del proceso en comparación esencialmente más complicado y por consiguiente más caro. 50

El objetivo de la invención es remediar mediante una oxidorreductasa los inconvenientes mencionados de los procedimientos del estado de la técnica.

Este objetivo se soluciona según la invención mediante una oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, y caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica 55 de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.

La invención se refiere entre otras cosas a oxidorreductasas, que pueden obtenerse por ejemplo a partir de Lactobacillus (L.) reuteri, L. kefiri, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus o L. fermentum.

La invención se refiere además a la oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri, que presenta la secuencia de 60 aminoácidos según la SEQ ID NO: 18, tal como se describe en el protocolo de secuencias adjunto.

Se prefieren oxidorreductasas que presentan del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. La

medición de la actividad específica de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18 o sus derivados o análogos tiene lugar con el sistema de prueba descrito en el ejemplo 2.

La invención se refiere además a una oxidorreductasa, caracterizada porque presenta de 1 a 50 aminoácidos más o de 1 a 50 aminoácidos menos que la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. Se prefieren oxidorreductasas en las que hay de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 3 5 a 10 aminoácidos más o menos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

La invención se refiere además a una oxidorreductasa que se caracteriza porque presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua. Un ejemplo de un polímero soluble en agua es polietilenglicol. La unión del polietilenglicol tiene lugar preferiblemente en el extremo N-terminal de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18. La oxidorreductasa según 10 la SEQ ID NO: 18 también puede estar unida a un cuerpo sólido tal como polietileno, poliestireno, polisacárido, celulosa o derivado de celulosa.

La invención se refiere además a una proteína de fusión que se caracteriza porque representa la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, y porque la oxidorreductasa está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxiterminal con un enlace peptídico. Las proteínas de fusión pueden 15 separarse por ejemplo más fácilmente de otras proteínas o se expresan en las células en mayores cantidades.

La invención se refiere además a un anticuerpo, que se une específicamente a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18. La producción de estos anticuerpos tiene lugar según métodos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados tales como el caballo, el ratón, la rata o el cerdo, y la obtención posterior de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. 20

La invención se refiere también a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.

La invención se refiere además a una secuencia de ácido desoxirribonucleico aislada (secuencia de ADN) de la oxidorreductasa, que cataliza la reducción de ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua... [Seguir leyendo]

1. Oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. 5

2. Oxidorreductasa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.

3. Oxidorreductasa según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. 10

4. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque puede obtenerse a partir de Lactobacillus (L.) reuteri, L. kefiri, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus o L. fermentum.

5. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta de 1 a 50 aminoácidos más o de 1 a 50 aminoácidos menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.

6. Oxidorreductasa según la reivindicación 5, caracterizada porque presenta de 1 a 25 aminoácidos, 15 especialmente de 2 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 10 aminoácidos más o menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.

7. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua. 20

8. Oxidorreductasa según la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol.

9. Proteína de fusión, caracterizada porque representa la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y porque la oxidorreductasa está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxiterminal a través de un enlace peptídico. 25

10. Anticuerpo, caracterizado porque se une específicamente a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.

11. Secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.

12. Secuencia de ADN aislada de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 9, seleccionándose la secuencia de ADN del grupo que consiste en

a) SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria, 30

b) una secuencia de ADN, que se hibrida con la SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria en condiciones rigurosas, y

c) una secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código genético codifica para una proteína, que también se codifica mediante una o varias de las secuencias de ADN según a) o b).

13. Secuencia de ADN aislada, caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia 35 de ADN SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria y codifica para una proteína, que presenta una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.

14. Secuencia de ADN aislada según la reivindicación 13, caracterizada porque presenta del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, preferiblemente del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de ADN 40 SEQ ID NO: 19.

15. Vector de clonación, caracterizado porque presenta una o varias de las secuencias de ADN según las reivindicaciones 11 a 14.

16. Vector de expresión, caracterizado porque presenta una o varias de las secuencias de ADN según las reivindicaciones 11 a 14 y está unido de manera adecuada con una secuencia de control de expresión. 45

17. Célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 16.

18. Procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, caracterizado porque se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 9, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido y se aísla el éster de S-2-50 hidroxiácido formado.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque como éster de 2-oxoácido se utiliza un compuesto de fórmula I,

R2-C(O)-C(O)-O-R1 (I)

en la que 55

R1 representa

1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado,

2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, 60 tres o cuatro triples enlaces,

4. -arilo (C6-C14),

5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7. -cicloalquilo (C3-C7) y

R2 representa

1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado, 5

2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,

4. -arilo (C6-C14), 10

5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7. -cicloalquilo (C3-C7),

estando los restos mencionados anteriormente en 1. a 7. no sustituidos o de mono a trisustituidos 15 independientemente entre sí con

a) -OH,

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

c) -NO2,

d) -C(O)-O-alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o de mono a 20 trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

e) -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro.

20. Procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, caracterizado porque

a) se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de una oxidorreductasa según una de las 25 reivindicaciones 1 a 9, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido,

b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADPH, y

c) se aísla el éster de S-2-hidroxiácido quiral formado.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque como éster de 2-oxoácido se utiliza un 30 compuesto de fórmula I según la reivindicación 19.

22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza la alcohol deshidrogenasa de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis y como cosustrato se usa etanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol.

23. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza la 35 glucosa deshidrogenasa y como cosustrato se utiliza glucosa o se utilizan la formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH y como cosustrato una sal del ácido fórmico tal como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque las reacciones se realizan en presencia de un disolvente orgánico. 40

25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque como disolvente orgánico se utiliza dietil éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter, dibutil éter, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque la fase orgánica asciende a del 5% al 80% del volumen de reacción total, preferiblemente del 10% al 40%.

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