POLINUCLEOTIDO CON MIMETICO DE FOSFATO.

Oligonucleótido que contiene al menos una vez la estructura **(Ver fórmula)** A representa el extremo 5'' de un nucleótido o de una cadena nucleótida,

B el extremo 3'' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y D es hidroxilo o CH3, Acc un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico, caracterizado porque Acc se elige de un grupo formado por

- -CN,

- -SO2-R'', donde R'' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio

Polinucleótido con mimético de fosfato.

La presente invención se refiere a nuevas sustancias y a sus métodos de preparación, en el sector de la química de los nucleótidos. Se trata de los llamados miméticos de fosfatos, en los cuales un grupo hidroxilo está sustituido por un mimético adecuado.

La presente invención se refiere particularmente a una nueva clase de oligonucleótidos modificados y a métodos para su preparación.

Estado técnico

Anteriormente ya se han descrito diferentes métodos de preparación de nucleótidos u oligonucleótidos modificados en el resto de fosfato.

Los (desoxi)oligonucleótidos sintéticos se preparan generalmente en una fase sólida mediante la química de la fosforamidita. Como fase sólida suelen usarse perlas de vidrio con poros de tamaño definido (en lo sucesivo llamadas de modo abreviado CPG = controlled pore glass [vidrio de poro controlado]). El primer monómero va unido al soporte mediante un grupo separable, con lo cual al terminar la síntesis en fase sólida se puede desprender el oligonucleótido libre. Además el primer monómero lleva un grupo hidroxilo protegido, usándose normalmente dimetoxitritilo (DMT) como grupo protector. El grupo protector se puede eliminar por tratamiento ácido. Luego, en un proceso cíclico, se acoplan sucesivamente derivados 3'-fosforamidita de (desoxi)ribonucléosidos - provistos asimismo de un grupo protector DMT en el extremo 5' - al respectivo grupo reactivo liberado del grupo protector. Como alternativa, en la síntesis inversa de oligonucleótidos se usan 5'-fosforamiditas protegidas con dimetoxitritilo en 3'. Especialmente, para introducir modificaciones en la estructura de fosfato, p.ej. para preparar fósforotioatos marcados radiactivamente, también se emplea la estrategia del H-fosfonato. Asimismo se conocen varias estrategias relativas a la preparación de oligonucleótidos modificados o marcados: para preparar oligonucleótidos marcados en el extremo 3' se emplean, según el estado técnico, materiales soporte trifuncionales (US 5,290,925, 5,401,837). Para preparar oligonucleótidos marcados en el extremo 5' se emplean habitualmente fosforamiditas marcadas con un grupo que va unido a la fosforamidita mediante un conector C3-12 (US 4,997,928, US 5,231,191). Además los oligonucleótidos se pueden modificar en las bases individuales (US 5,241,060, US 5,260,433, US 5,668,266) o introduciendo conectores internos no nucleósidos (US 5,656,744, US 6,130,323).

Como alternativa pueden marcarse en el internucleósido-fosfato por marcación postsintética de fósforotioatos (Hodges, R.R., y otros, Biochemistry 28 (1989) 261-7) o marcando a posteriori un fosforamidato funcionalizado (S. Agrawal en Methods in Mol. Biology [Métodos en biología molecular], vol. 26, Protocols for Oligonucleotide Conjugates [Protocolos para conjugados de oligonucleótidos], Humana Press, Totowa, NJ, 1993, capítulo 3). Sin embargo estos métodos no han impuesto, debido a la inestabilidad de los fosforamidatos y de los tio-ésteres del ácido fosfórico.

También se conoce del estado técnico la introducción de modificaciones en el resto de fosfato del inter-nucleósido. En los casos principales se trata de fósforotioatos (Burgers, Peter M.J. y Eckstein, Fritz, Biochemistry 18, (1979) 592-6), fosfonatos de metilo (Miller, P.S. y otros, Biochemistry 18 (1979) 5134-43) o borano-fosfatos (WO 91/08213). Para preparar metilfosfonato-oligonucleótidos hay que sintetizar monómeros especiales. En cambio para sintetizar fósforotioatos y borano-fosfatos se pueden usar fosforamiditas o H-fosfonatos, introduciendo directamente la borano- o tiomodificación por medio de reactivos especiales que reaccionan con el H-fosfonato trivalente o con el triéster de ácido fosfónico, durante o después de la síntesis del oligonucleótido. Aunque todos estos métodos dan lugar a oligonucleótidos modificados, las condiciones de la química de síntesis aplicada en ellos no permite introducir directamente de esta manera marcaciones detectables o grupos funcionales en la estructura de fosfato, durante la síntesis de los oligonucleótidos.

Baschang, G. y Kvita, V. describen en Angewandte Chemie [Química aplicada] 85(1) (1973) 43-44 la reacción de un nucleótido-triéster de ácido fosfórico con azidas, como por ejemplo metil-sulfonil-azida, para preparar tri-alquil(aril)-imidofosfatos, que de todos modos son inestables y se descomponen.

Nielsen, J. y Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 6275-6276, describen la reacción de desoxinucleósido-fosfitos dotados de un grupo protector 2-ciano-1,1,-dimetil-etilo, en presencia de alquil-azida. Además los autores exponen que este principio es adecuado para preparar nucleótidos modificados en el resto de fosfato, sin detallar qué tipo de modificaciones efectuadas con la ayuda del método revelado podrían presentar ventajas especiales. Los autores proponen especialmente la introducción de radicales alquilo.

La patente WO 89/091221 revela N-alquil-fosforamidatos u oligonucleótidos sustituidos con N-alquilo en, al menos, un resto fosfato, que se preparan por oxidación de nucleósido-fosfitos (provistos de un grupo protector) con yodo en presencia de alquilaminas apropiadas.

La patente WO 03/02587 revela la preparación de oligonucleótidos modificados, en los cuales se convierten H-fosfatos en fósforo-amidatos por aminación.

Así pues, todas estas publicaciones describen la preparación de moléculas que en vez de un resto de fosfato contienen un fosforamidato. Sin embargo, las moléculas que llevan fosforamidato son sensibles a la hidrólisis, porque el grupo amino se protona en medio ácido y puede sustituirse por agua.

Además la patente WO 01/14401 propone bloques funcionales de nucleótidos u oligonucleótidos en que un resto de fosfato está sustituido con N--ClO3, N--NO2 o N--SO2R. Según revela la patente WO 01/14401 tales sustancias pueden prepararse por reacción del grupo hidroxilo libre de un desoxi-nucleósido con cloruro de amidofosfonilo en presencia de piridina. Sin embargo este modo de preparación es complejo, requiere mucho tiempo y no es apropiado para síntesis rutinarias de nucleótidos y oligonucleótidos.

El planteamiento técnico de la presente invención consistía pues en proporcionar mejores oligonucleótidos marcados y métodos sencillos para su preparación.

Descripción breve de la presente invención

Por lo tanto la presente invención tiene por objeto un oligonucleótido que contiene al menos una vez la estructura

donde

A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y

B el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena nucleótida,

D es hidroxilo o CH3 y

Acc un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico, y

Acc se elige de un grupo formado por

- -CN,

- -SO2-R', donde R' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.

Se prefieren particularmente los oligonucleótidos en que R o R', solos o combinados, contienen una unidad o un grupo funcional detectable.

Según la presente invención, estos oligonucleótidos se preparan mediante métodos caracterizados porque un derivado fosfórico trivalente correspondiente a la estructura química

donde E es un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido,

donde A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y

donde B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena nucleótida,

se hace reaccionar con una azida de estructura

N=N=N-Acc,

donde Acc se escoge de un grupo formado por

- -CN, -SO2-R'

- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.

En una forma de...

1. Oligonucleótido que contiene al menos una vez la estructura

donde

A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena nucleótida,

B el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y

D es hidroxilo o CH₃,

Acc un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico,

caracterizado porque Acc se elige de un grupo formado por

- -CN,

- -SO2-R', donde R' contiene como mínimo un alquilo sustituido con amino, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido,

- y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.

2. Método para preparar un oligonucleótido modificado según la reivindicación 1, caracterizado porque un derivado fosfórico trivalente correspondiente a la estructura química

donde E es un grupo metilo o un grupo hidroxilo protegido,

donde A representa el extremo 5' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, y

donde B representa el extremo 3' de un nucleótido o de una cadena nucleótida, se hace reaccionar con una azida de la estructura

N=N=N-Acc,

donde Acc es un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R cualquier sustituyente orgánico,

caracterizado porque

Acc se escoge de un grupo formado por

-CN, -SO2-R'

y heterociclos-N+ de seis miembros escogidos de un grupo formado por piridinio, pirimidinio y quinolinio.

3. Método según la reivindicación 2, que consta de los siguientes pasos

a) la reacción de una 3'-fosforamidita con el extremo 5'-OH de un oligonucleótido naciente y a continuación

b) la reacción con una azida de estructura

N=N=N-Acc,

en que Acc es un aceptor de electrones, opcionalmente sustituido con un radical R, siendo R un sustituyente orgánico cualquiera.

4. Uso de un oligonucleótido según la reivindicación 1 como componente de hibridación.

5. Uso según la reivindicación 4 como sonda de hibridación.