MUTEINAS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS 21.

Una muteína del FGF-21 humano, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1,

en la que dicha muteína es deltaHisProIlePro/Leu118Cys/Ala134Cys/Ser167Ala

Muteínas del factor de crecimiento de fibroblastos 21.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de nuevas muteínas del factor de crecimiento de fibroblastos 21 que tienen una glicosilación unida por O cuando se expresan en levaduras.

Los factores de crecimiento de fibroblastos son polipéptidos de tamaño grande que se expresan ampliamente en el desarrollo en tejidos adultos (Baird y col., Cancer Cells, 3: 239-243, 1991) y desempeñan papeles cruciales en múltiples funciones fisiológicas, incluidas la angiogénesis, la mitogénesis, la información del patrón, la diferenciación celular, la regulación metabólica y la reparación de lesiones tisulares (McKeehan y col., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59: 135-176, 1998). De acuerdo con la literatura publicada, la familia de FGF consta de al menos veintitrés miembros, FGF-1 a FGF-23 (Reuss y col., Cell Tissue Res. 313: 139-157 (2003). Se ha comunicado que el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21) se expresa, preferentemente, en el hígado (Nishimura y col., Biochimica et Biophysica Acta, 1492: 203-206, 2000); documentos WO01/36640 y WO01/18172) y se describe como un tratamiento para la enfermedad vascular isquémica, la cicatrización de heridas y las enfermedades asociadas con la pérdida de función de las células pulmonares, bronquiales o alveolares y otros numerosos trastornos. Más recientemente, se ha demostrado que el FGF-21 estimula la captación de glucosa en adipositos de ratón 3T3-L1 tras tratamiento prolongado (72 h), en presencia y ausencia de insulina, y que disminuye los niveles de glucosa, triglicéridos y glucagón en sangre, en ayunas y sin ayunar, en ratones ob/ob y db/db y ratas ZDF de 8 semanas de edad de un modo dependiente de la dosis, lo que proporciona la base para el uso de FGF-21 como tratamiento para tratar la diabetes y la obesidad (documento WO03/011213).

El desarrollo de tecnología de ADN recombinante ha posibilitado la producción de productos extraños tales como muteínas del FGF-21 en células huésped en las que se han introducido secuencias de ADN exógeno que codifican dichos productos. La ventaja de esta tecnología es que los productos se pueden producir en rendimientos elevados, en forma altamente purificada, con un bajo riesgo de contaminación tal como contaminación viral. Estas técnicas recombinantes se han usado ampliamente para la producción de proteínas recombinantes en células huésped procarióticas así como eucarióticas.

No obstante, la producción a gran escala de productos recombinantes mediante estas técnicas todavía es limitada debido a problemas de la eficiencia de la expresión de estas secuencias de ADN exógeno, debido también a la inestabilidad del vector y a la degradación intracelular de los productos recombinantes por la célula huésped en las que se fabrican. Además, a menudo los productos recombinantes son diferentes de sus homólogos naturales. Por ejemplo, los productos recombinantes producidos en huéspedes eucarióticos heterólogos normalmente difieren de su homólogo natural en su contenido de glicosilación. Esto puede afectar a la presencia frente a la ausencia de cualquier estructura de hidratos de carbono, la localización de dicha estructura de hidratos de carbono sobre el producto, así como la naturaleza del hidrato de carbono. Más específicamente, se ha demostrado que los productos recombinantes derivados de levaduras a menudo llevan O-glicanos no naturales adicionales en comparación con su homólogo natural (Van den Steen, y col., Crit. Reviews in Biochem. y Mole. Biol. 33(3): 151-208, 1998).

La presente invención resuelve el problema de la O-glicosilación anómala asociada con proteínas recombinantes derivadas de levaduras proporcionando una muteína del FGF-21 que tiene una cantidad reducida de la O-glicosilación en comparación con el FGF-21 cuando se expresa en levaduras. Los solicitantes han descubierto que las muteínas del FGF-21 con O-glicosilación reducida pueden producirse en condiciones de fermentación industrial y que mantienen la actividad biológica necesaria para ser útil para tratar a sujetos con trastornos, incluidos, entre otros, diabetes de tipo II, obesidad y síndrome metabólico.

Resumen de la invención

En una primera forma de realización, la presente invención proporciona una muteína de FGF-21 humano, en el que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº 1, en la que dicha muteína es ?HisProIlePro/Leu118Cys/ Ala134Cys/Ser167Ala.

Otra forma de realización lleva a un procedimiento para producir la muteína de la presente invención, que comprende:

(a) transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica dicha muteína;

(b) cultivar dicha célula huésped en un medio adecuado para expresar dicha muteína; y

(c) aislar dicha muteína del medio de cultivo.

Otra forma de realización más lleva al uso de la muteína de FGF-21 de la presente invención para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que exhiben uno o más de obesidad, diabetes de tipo II, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia o síndrome metabólico.

Descripción detallada de la invención

Para los propósitos de la presente invención, tal como se divulga y reivindica en la presente memoria descriptiva, los términos siguientes son como se define a continuación.

El FGF-21 es un polipéptido de 208 aminoácidos que contiene una secuencia líder de 27 aminoácidos. El FG-21 humano tiene una identidad de aminoácidos del ~79% con el FGF-21 de ratón y una identidad de aminoácidos del ~80% con el FGF-21 de rata. El FGF-21 humano es el molde polipeptídico para la muteína de la presente invención, pero se reconoce que un experto en la técnica podría fabricar fácilmente muteínas basadas en una secuencia polipeptídica alternativa de FGF-21 de mamíferos.

Las posiciones de los aminoácidos de la muteína de la presente invención se determinan a partir polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos como se muestra a continuación (SEC ID Nº 1):

La correspondiente secuencia de ADN que codifica el polipéptido de FGF-21 de 181 aminoácidos es (Sec ID Nº: 2):

Los aminoácidos se identifican usando el código de tres letras o, como alternativa, se designan usando el código estándar de una letra. Las mutaciones se designan con el código de tres letras para el aminoácido original, seguido por el número de aminoácido, seguido por el código de tres letras para el aminoácido de sustitución. Las designaciones numéricas de cada muteína se basan en la secuencia de 181 aminoácidos del FGF-21 humano salvaje maduro. Por ejemplo, una sustitución por serina en la posición 167 (es decir, Ser167) con el aminoácido apolar/hidrófobo alanina (Ala) se designa como Ser167Ala o S167A. De un modo similar, la sustitución doble por leucina en la posición 118 y alanina en la posición 134 (Leu118, Ala134) con el aminoácido que contiene azufre cisteína (Cys) se designa como Leu118Cys/A1a134Cys o L118C/A134C.

El término "aminoácido" se usa en la presente memoria descriptiva en su sentido más amplio e incluye aminoácidos naturales así como aminoácidos no naturales, incluidos análogos de aminoácidos y derivados. Este último incluye moléculas que contienen un resto aminoácido. Un experto en la técnica reconocerá, en vista de esta amplia definición, que la referencia a un aminoácido en la presente memoria descriptiva incluye, por ejemplo, aminoácidos L proteogénicos naturales; aminoácidos D; aminoácidos químicamente modificados tales como análogos y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos naturales tales como norleucina, ß-alanina, ornitina etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica como característicos de los aminoácidos.

Una muteína del FGF-21 humano se define como que comprende FG-21 humano en el que al menos un aminoácido de la proteína salvaje madura se ha sustituido por otro aminoácido. Ejemplos de muteínas de FGF-21 se describen en la solicitud de patente internacional WO 2005/061712. En general, una muteína posee alguna propiedad modificada, estructural...

1. Una muteína del FGF-21 humano, en la que la numeración de los aminoácidos se basa en la SEC ID Nº1, en la que dicha muteína es

?HisProIlePro/Leu118Cys/Ala134Cys/Ser167Ala.

2. Un procedimiento de producir la muteína de la reivindicación 1, que comprende:

(a) transformar una célula huésped con un vector que contiene ADN que codifica dicha muteína;

(b) cultivar dicha célula huésped en un medio adecuado para expresar dicha muteína; y

(c) aislar dicha muteína del medio de cultivo.

3. Una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de un paciente que exhibe una o más de obesidad, diabetes de tipo II, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia o síndrome metabólico, que comprende las siguientes:

(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de la muteína del FGF-21 de la reivindicación 1; y

(b) un transportador farmacéutico aceptable.

4. Una muteína del FGF-21 humano, o un péptido biológicamente activo del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, para usar como medicamento.

5. Una muteína del FGF-21 humano, o un péptido biológicamente activo del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, para usar en el tratamiento de la obesidad, la diabetes de tipo II, la resistencia a la insulina, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la hiperglucemia o el síndrome metabólico.