MOLECULAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA ENZIMA RAMIFICADORA PROCEDENTE DE BACTERIAS DEL GENERO NEISSERIA, ASI COMO PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE ALFA-1,4-GLUCANOS RAMIFICADOS EN LAS POSICIONES ALFA-1,6.

Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria,

seleccionada entre el conjunto que se compone de

(a) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos que se indica dentro de SEQ ID NO: 2;

(b) moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la región codificadora que se indica dentro de SEQ ID NO: 1;

(c) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una proteína, que comprende la secuencia de aminoácidos, que es codificada por la inserción en el plásmido DSM 12425;

(d) moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la región codificadora contenida en la inserción en el plásmido DSM 12425 para una enzima ramificadora;

(e) moléculas de ácidos nucleicos, que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, cuya secuencia en la región de los primeros 100 aminoácidos presenta una identidad entre secuencias de por lo menos un 65% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada dentro de SEQ ID NO: 2;

(f) moléculas de ácidos nucleicos, cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a), (b), (c), (d) y/o (e), y que codifican una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria; y

(g) moléculas de ácidos nucleicos, cuya secuencia se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (f) a causa de la degeneración del código genético

Moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias del género Neisseria, así como procedimientos para la preparación de a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6.

El presente invento se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican una enzima ramificadora procedente de bacterias de género Neisseria, a vectores, a células anfitrionas, a células de plantas y a plantas que contienen dichas moléculas de ácidos nucleicos, así como a procedimientos para la producción de un almidón.

Los a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6 presentan un extraordinario interés en diferentes aspectos, puesto que ellos son idóneos por ejemplo para la producción de productos en el sector de las industrias farmacéutica y cosmética. Por ejemplo, ellos se pueden utilizar como agentes aglutinantes para tabletas, como materiales de vehículo para sustancias activas farmacéuticas, como un material para envasar, como un material de soporte para sustancias aditivas a polvos para espolvorear, como sustancia aditiva absorbente de los rayos UV (ultravioletas), en cremas de protección contra el sol y como material de soporte o de vehículo de sustancias aromatizantes u odoríferas.

Los a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6 se presentan en el reino vegetal principalmente como una amilopectina como un componente del almidón. En el reino animal y en bacterias estos glucanos ramificados aparecen principalmente en forma de glicógeno.

El polisacárido almidón está constituido a base de eslabones fundamentales químicamente uniformes, a saber las moléculas de glucosa, pero constituye una compleja mezcla de diferentes formas de moléculas, que presentan diferencias en lo que se refiere al grado de polimerización y al grado de ramificación, y por consiguiente se diferencian grandemente unas de otras en sus propiedades físicas y químicas. Se establece diferencia entre el almidón de amilosa, que es un polímero esencialmente no ramificado a base de unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos en las posiciones a-1,4, y el almidón de amilopectina, que es un polímero ramificado en el que las ramificaciones pueden realizarse mediante la aparición de adicionales enlaces glicosídicos en las posiciones a-1,6. De acuerdo con los datos de un manual (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990), las ramificaciones en las posiciones a-1,6 aparecen en promedio por cada 24 a 30 radicales de glucosa. Esto corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 3%-4%. Los datos acerca del grado de ramificación son variables y dependientes de la procedencia (p.ej. una especie de planta, una variedad vegetal, etc.) del respectivo almidón. En unas típicas plantas utilizadas para la producción de almidón a escala industrial, la proporción de amilosa en el contenido global de almidón varía entre 10 y 25%. Para la preparación de a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6, con diverso grado de ramificación, ya se describieron diferentes enfoques, que comprenden la utilización de plantas (transgénicas).

Así, por ejemplo, la expresión heteróloga de una glicógeno sintasa bacteriana en plantas de patata conduce a una ligera disminución del contenido de amilosa, a un aumento del grado de ramificación y a una modificación del modelo de ramificaciones de la amilopectina en comparación con plantas de tipo salvaje (Shewmaker y colaboradores, Plant. Physiol. 104 (1994), 1159-1166). Además, se observó que la expresión heteróloga de la enzima ramificadora procedente de E. coli (glgB) en unas mutantes de patatas exentas de amilosa (amf) (Jacobsen y colaboradores, Euphytica 44 (1989), 43-48) conducía a unas moléculas de amilopectina con un 25% más de sitios de ramificación (Kortstee y colaboradores, Plant J. 10 (1996), 83-90) que el testigo (amf). El aislamiento de los glucanos con diverso grado de ramificación, producidos en plantas transgénicas, necesita para la eliminación p.ej. del componente amilosa, unas etapas de purificación adicionales, que son muy costosas y por lo tanto necesitan una intensa dedicación de tiempo y de costos. Además, no es posible un ajuste deliberado del grado de ramificación con tales enfoques. Por lo demás, tales procedimientos in vivo, a causa de las condiciones fluctuantes de los ensayos (factores medioambientales, sitio de localización) poseen una alta variabilidad en lo que se refiere a la calidad de los productos.

Un grado de ramificación más alto que el de la amilopectina lo tiene el glicógeno. También este polisacárido contiene a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6. El glicógeno se diferencia del almidón también en la longitud media de las cadenas laterales y en el grado de polimerización. El glicógeno, de acuerdo con los datos de un manual (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) contiene en promedio por cada 8 a 12 radicales de glucosa un sitio de ramificación en a-1,6. Esto corresponde a un grado de ramificación de aproximadamente 8% a 12%. Para el peso molecular de un glicógeno se encuentran diferentes datos, que se extienden desde 1 millón hasta de más 1.000 millones (D. J. Manners en: Advances in Carbohydrate Chemistry (Avances en la química de los hidratos de carbono), coordinador de edición M. L. Wolfrom, Academic Press, Nueva York (1957), 261-298; Geddes y colaboradores Carbohydr. Res. 261 (1994), 79-89). También estos datos son grandemente dependientes del respectivo organismo de origen, de su estado de nutrición, así como del modo de realizar el aislamiento del glicógeno. Un glicógeno es obtenido por regla general a partir de moluscos (p.ej. Mytillus edulis), a partir de hígados o músculos de mamíferos (p.ej. conejos, ratas) (Bell y colaboradores Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding y Orrell, J. Biol. Chem. 236 (1961), 2854). Esto hace que una producción a la escala industrial necesite una intensa dedicación de tiempo y de costos.

Los descritos a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6, almidón y glicógeno, que aparecen de un modo natural, que se han descrito, se comportan de una manera muy diversa, dependiendo de su proporción de ramificaciones glicosídicas en las posiciones 1,6. Esto es válido, entre otras cosas, en lo que se refiere a su solubilidad, su transparencia, su hidrólisis enzimática, su reología, y sus propiedades de formación de geles y de retrogradación. Sin embargo, una tal fluctuación en las propiedades no siempre es tolerable para muchas aplicaciones industriales.

Una alternativa para la obtención de a-1,4-glucanos ramificados en las posiciones a-1,6 a partir de plantas u organismos animales la constituyen unos enfoques in vitro. Estos se distinguen, en comparación con los procedimientos in vivo, por lo general, por una mejor regulabilidad y por una reproducibilidad más alta, puesto que las condiciones de reacción in vitro se pueden ajustar de una manera definida, al contrario que las condiciones que se presentan en un organismo vivo. Esto hace posible por regla general la producción de productos invariables con una gran uniformidad y una gran pureza y por consiguiente una gran calidad, lo que es de gran importancia para el uso industrial ulterior. El tratamiento de productos con una calidad invariable conduce a disminuciones de los costos, puesto que los parámetros de procedimiento, que son necesarios para el tratamiento, no tienen que volver a ser optimizados de nuevo para cada tanda de tratamiento. Otra ventaja adicional de determinados procedimientos in vitro consiste en que los productos están libres de los organismos que se utilizan en el procedimiento in vivo. Para determinadas aplicaciones en la industria alimentaria y en la industria farmacéutica esto es imperativamente necesario.

Los procedimientos in vitro se pueden subdividir en términos generales en dos diferentes conjuntos.

En el caso de uno de los conjuntos de procedimientos, se someten diferentes substratos, tales como p.ej. amilosa, amilopectina y glicógeno, a la actividad de una enzima ramificadora.

Así, Borovsky y colaboradores (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625) pudieron mostrar que la utilización de la enzima ramificadora procedente de patata, en unión con el substrato amilosa, conduce a unos productos, que ciertamente son similares a una amilopectina, pero sin embargo se diferencian estructuralmente de ésta.

Boyer y Preiss (Biochemistry 16 (1977), 3693-3699) mostraron además que se puede utilizar una enzima ramificadora purificada (a-1,4-glucano: a-1,4-glucano 6-glicosil-transferasa) procedente de E. coli, con el fin de aumentar...

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una enzima ramificadora procedente de una bacteria del género Neisseria, seleccionada entre el conjunto que se compone de

2. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Vector de acuerdo con la reivindicación 2, estando la molécula de ácido nucleico unida en orientación en el mismo sentido (in sense) con unas secuencias reguladoras, que garantizan la transcripción en células procarióticas o eucarióticas.

4. Célula anfitriona, que es transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 2 o 3.

5. Procedimiento para la producción de una enzima ramificadora a partir de una bacteria del género Neisseria, siendo cultivada una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 4 en unas condiciones que permiten la expresión de la proteína, y siendo aislada la proteína a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

6. Procedimiento para la producción de una enzima ramificadora a partir de una bacteria del género Neisseria, siendo producida la proteína en un sistema de transcripción y traducción in vitro mediando utilización de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

7. Enzima ramificadora codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 u obtenible mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.

8. Anticuerpo, que reconoce específicamente una proteína de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Utilización de una proteína de acuerdo con la reivindicación 7, para la preparación de a-1,4-glucanos ramificados en a-1,6 en sistemas in vitro.

10. Célula de planta transgénica que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, estando la molécula de ácido nucleico unida con unas secuencias reguladoras, que garantizan la transcripción en células de plantas.

11. Célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, estando unida la molécula de ácido nucleico con una secuencia, que codifica una secuencia de señal, que garantiza la localización de la proteína codificada en los plastidios de las células.

12. Planta transgénica que contiene células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

13. Procedimiento para la producción de una planta transgénica, realizándose que

14. Partes de plantas cosechables de plantas de acuerdo con la reivindicación 12 o de plantas obtenibles mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, conteniendo estas partes de plantas unas células de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

15. Célula de planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 y partes de plantas de acuerdo con la reivindicación 14, siendo la planta una planta de patata y procediendo las células de plantas y las partes de plantas de plantas de patata.

16. Procedimiento para la producción de un almidón, que comprende la extracción del almidón a partir de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 12 o 15, a partir de plantas transgénicas mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 o 15, a partir de partes que almacenan almidón de una de tales plantas o a partir de células de plantas de acuerdo con la reivindicación 10, 11 o 15.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, siendo producido un almidón de patata, que, en comparación con un almidón procedente de correspondientes plantas de tipo salvaje, presenta una proporción porcentual aumentada en por lo menos un 10% de granos de almidón que tienen un tamaño de granos de hasta 15 µm.

18. Región reguladora, que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el conjunto que se compone de: