Generación de bloques de construcción químicos de biomasa vegetal por despolimerización selectiva.

Procedimiento para el tratamiento enzimático de materia prima polimérica en bruto que comprende las siguientes etapas:

a) tratar la materia prima polimérica en bruto insoluble con un sistema de enzimas con el fin de liberar un bloque de construcción monomérico u oligomérico soluble definido de la materia prima polimérica en bruto;

b) separar el bloque de construcción monomérico u oligomérico soluble definido producido en la etapa a) del resto de la materia prima polimérica en bruto insoluble,

en el que las etapas a) y b) se repiten una o más veces con diferentes sistemas de enzimas con el fin de liberar del resto de la materia prima polimérica en bruto (materia prima polimérica procesada) otros bloques de construcción monoméricos u oligoméricos solubles definidos, y en el que un bloque de construcción monomérico u oligomérico definido según la etapa a) es arabinosa,

en el que el sistema de enzimas que da la mayor pureza de un bloque de construcción monomérico y oligomérico definido después del tratamiento de la materia prima polimérica en bruto y separación de la materia prima monomérica y oligomérica definida de la materia prima polimérica procesada se elige para el primer tratamiento enzimático según la etapa a),

en el que el segundo sistema de enzimas según la etapa a) es el que da la mayor pureza del bloque de construcción monomérico y oligomérico definido después del tratamiento de la materia prima polimérica procesada, que se obtiene por el primer tratamiento enzimático según la etapa a) y separación de la materia prima monomérica y oligomérica definida de la materia prima polimérica en bruto, con el sistema de enzimas y separación de la materia prima monomérica y oligomérica definida de la materia prima polimérica procesada,

y en el que cualquier etapa de tratamiento enzimático posterior se realiza con el fin de disminuir la pureza de los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos después del tratamiento de la materia primera procesada obtenida de la etapa de tratamiento enzimático previa con el sistema de enzimas respectivo y separación de los bloques de construcción monoméricos y oligoméricos definidos de las materias primas poliméricas procesadas,

y en el que el sistema de enzimas para liberar arabinosa contiene no más del 50 % de otras actividades enzimáticas, aparte de la actividad enzimática que produce la liberación de arabinosa de la materia prima polimérica en bruto o procesada según la etapa a).

Generación de bloques de construcción químicos de biomasa vegetal por despolimerización selectiva Antecedentes de la invención La generación de bloques de construcción químicos de base biológica de recursos renovables ha atraído recientemente mayor atención debido a la limitación global de recursos petroquímicos fósiles. Las materias primas preferidas para la generación de tales productos químicos de base biológica se derivan de biomasa vegetal renovable (Kamm y col., 2006) .

Los actuales procedimientos de fabricación para productos predominantemente de base biológica utilizan sustratos del mercado de los alimentos y piensos tales como aceites, azúcares y almidones. La mayoría de las materias primas de primera generación son de composición química bien definida y baja complejidad estructural.

Adicionalmente, estos sustratos pueden obtenerse en pureza relativamente alta con solo cantidades menores de contaminantes acompañantes. Aunque su uso es tanto tecnológicamente como económicamente atractivo, su continuo suministro a gran escala no es seguro debido a que el uso de materias primas de primera generación en procedimientos químicos de base biológica está en una fiera competición con su demanda global cada vez mayor en la industria alimentaria.

Sustratos alternativos de las materias primas de primera generación anteriormente mencionadas se derivan de los subproductos de silvicultura de bajo coste y residuos agrícolas que constituyen el material vegetal que no tiene aplicación como fuente de alimento. Ejemplos de estas designadas materias primas de segunda generación son material vegetal residual de actividades agrícolas tales como hoja y tallo de maíz y paja de trigo, además de diversos residuos relacionados con la madera. Esta biomasa lignocelulósica (BLC) se distingue de las materias primas biológicas de primera generación por su compleja composición química y estructural. Los componentes primarios de BLC son materiales altamente poliméricos tales como celulosa (aprox. 35-50 % en peso/peso) , hemicelulosa (aprox. 20-35 % en peso/peso) y ligninas (aprox. 10-25 % en peso/peso) . Las proteínas, lípidos y otros compuestos constituyen fracciones menores en la mayoría de los materiales de partida de BLC (Saha, 2005) , pero pueden estar presentes en mayores cantidades en residuos agrícolas especiales tales como residuos de la producción de aceite. Como la BLC está compuesta por múltiples componentes químicamente diversos, su procesamiento aguas abajo es técnicamente difícil, que a su vez limita la factibilidad económica de los actuales procedimientos biológicos basados en BLC.

El documento US 2 444 823 A se refiere a recuperación de pentosas y hexosas de licores de madera. El documento US 6 586 212 B1 se refiere a fibra de maíz para la producción de productos químicos y materiales avanzados: celulosa derivatizable y derivados de celulosa preparados a partir de la misma. El documento WO 03/093420 A se refiere a procedimientos para la hidrólisis enzimática de lignocelulosa. El documento EP 0 884 391 A se refiere a procedimiento de pretratamiento mejorado para la conversión de celulosa en etanol para combustible. El documento US 4 089 745 A se refiere al procedimiento de conversión enzimática de celulosa derivada de cáscaras de maíz en glucosa. El documento EP 0 406 617 A se refiere a la deslignificación enzimática de material lignocelulósico. El documento WO 99/11672 A se refiere al fraccionamiento de materiales hemicelulósicos. El documento US 2002/195213 A1 se refiere al progreso para producir xilooligosacárido a partir de pulpa de lignocelulosa. El documento EP 0 062 027 A se refiere al procedimiento de preparación de monosacáridos y la disposición para llevar

a cabo el procedimiento. Yoon y col., Lebensmittelwissenschaft und Technologie, Academic Press, Londres, GB, vol.

39. nº 4, 1 de mayo de 2006, páginas 388-392, se refiere a la producción enzimática de pentosas de la fracción de hemicelulosa de residuos de maíz. Sorensen y col., Enzyme and Microbial Technology; Stoneham; MA; EE.UU.; vol. 40, nº 4, 16 de febrero de 2007, páginas 908-918, se refiere a mecanismos enzimáticos sinérgicos y efectos de adiciones de enzima secuenciales sobre la degradación de arabinoxilano de trigo insoluble en agua. Zhang y col., Biotechnology and Bioengineering; vol. 88; nº 7; 10 de noviembre de 2004, página 797-824, se refiere a un entendimiento agregado de la hidrólisis enzimática de sistemas de celulosa:celulasa no complejada.

Shang-Tian Yang, Capítulo 1 Bioprocessing from Biotechnology to Biorefiner y , Bioprocessing for value-added products from renewable resources: new technologies and applications, Elsevier, NL, páginas 1 -24, desvela una 55 biorrefinería integrada con fermentación en estado sólido para producir xilanasa y celulasa para la hidrólisis de hemicelulosa y celulosa en xilosa y glucosa.

Hanchar y col., Applied Biochemistr y and Biotechnology, vol. 136-140, páginas 313-325, desvelan la separación de los azúcares glucosa y pentosa por hidrólisis enzimática selectiva.

Problema técnico Con el fin de producir valiosas sustancias químicas y bloques de construcción mediante procedimientos biológicos económicamente viables basados en materias primas de BLC, es importante tanto (i) recuperar y refinar la mayoría 65 de sus diversos constituyentes químicos como (ii) producirlos en pureza suficiente. A diferencia de las diversas entidades y altamente poliméricas que constituyen la BLC, sus productos de procesamiento favorecidos son de bajo peso molecular. Principalmente, los productos económicamente atractivos pueden generarse de todos los componentes de BLC: La glucosa generada a partir de celulosa es un material de partida versátil para la generación de productos intermedios químicos de alto valor tales como sorbitol. Los azúcares de pentosa tales como xilosa y arabinosa deducidas de fracciones de hemicelulosa de BLC son materiales de partida para edulcorantes poco nutritivos de alto valor y no calorigénicos tales como xilitol y arabinitol. Las proteínas de BLC pueden hidrolizarse para dar L-aminoácidos puros en enantiómeros. Las ligninas pueden servir de fuente de compuestos fenólicos que sustituyen compuestos aromáticos producidos por procedimientos petroquímicos. La presente limitación tecnológica para el uso de materias primas de segunda generación está principalmente asociada con su compleja composición química.

Los procedimientos más actuales que usan BLC se concentran en la parte de celulosa del sustrato. Cuando se usan otros componentes normalmente se hidrolizan por etapas de procedimiento no selectivas tales como pretratamiento con ácido sulfúrico hidrolizando todas las hemicelulosas en una única etapa de procedimiento. Los productos de estas etapas de procedimiento no selectivas son generalmente de bajo valor comercial y en algunos casos negativos.

El procedimiento de Logen que opera presentemente para la producción fermentativa de bioetanol usa pretratamiento con corriente de ácido diluido a 200-250 ºC para movilizar la fracción de hemicelulosa de BLC, que contiene una mezcla de diferentes azúcares de hexosa y pentosa. En una etapa enzimática separada, la fracción de celulosa insoluble se hidroliza a azúcares de hexosa (glucosa) . Después de la licuefacción de las fracciones de hemicelulosa y celulosa, sólidos de lignina insolubles se separan físicamente de la mezcla y se queman para generar energía para el procesamiento en la dirección aguas abajo de las fracciones de BLC restantes. Las fracciones de celulosa y hemicelulosa combinadas se fermentan juntas en una única etapa para producir bioetanol. El etanol resultante se recupera posteriormente del caldo de fermentación mediante destilación. Como la mayoría de los organismos comercialmente disponibles (es decir, levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae) usados para el procedimiento de fermentación no pueden utilizar azúcares de pentosa, estos componentes de LOB, sin embargo de valor comercial significativo cuando están presentes en forma pura, se desechan en el procedimiento junto con el restante residuo de desecho (Lawford y Rousseau, 2003) .

Recientemente se han hecho intentos para poner la fracción de pentosa de BLC disponible para la conversión fermentativa a bioetanol. En este diseño de procedimiento revisado, la fracción de hemicelulosa licuada se separa de los componentes restantes de BLC después de la etapa de pretratamiento. Aunque todas las fracciones de BLC restantes se procesan como se describe previamente, especialmente microorganismos manipulados (es decir, cepas manipuladas de Zymomonas mobilis) con la capacidad de utilizar pentosa (Lawford y Rousseau, 2003; Lynd y col.,

2005) , además... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el tratamiento enzimático de materia prima polimérica en bruto que comprende las siguientes etapas:

a) tratar la materia prima polimérica en bruto insoluble con un sistema de enzimas con el fin de liberar un bloque de construcción monomérico u oligomérico soluble definido de la materia prima polimérica en bruto;

b) separar el bloque de construcción monomérico u oligomérico soluble definido producido en la etapa a) del resto de la materia prima polimérica en bruto insoluble,

en el que las etapas a) y b) se repiten una o más veces con diferentes sistemas de enzimas con el fin de liberar del resto de la materia prima polimérica en bruto (materia prima polimérica procesada) otros bloques de construcción monoméricos u oligoméricos solubles definidos, y en el que un bloque de construcción monomérico u oligomérico definido según la etapa a) es arabinosa,

en el que el sistema de enzimas que da la mayor pureza de un bloque de construcción monomérico y oligomérico definido después del tratamiento de la materia prima polimérica en bruto y separación de la materia prima monomérica y oligomérica definida de la materia prima polimérica procesada se elige para el primer tratamiento enzimático según la etapa a) ,

en el que el segundo sistema de enzimas según la etapa a) es el que da la mayor pureza del bloque de construcción monomérico y oligomérico definido después del tratamiento de la materia prima polimérica procesada, que se obtiene por el primer tratamiento enzimático según la etapa a) y separación de la materia prima monomérica y

oligomérica definida de la materia prima polimérica en bruto, con el sistema de enzimas y separación de la materia prima monomérica y oligomérica definida de la materia prima polimérica procesada,

y en el que cualquier etapa de tratamiento enzimático posterior se realiza con el fin de disminuir la pureza de los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos después del tratamiento de la materia primera procesada obtenida de la etapa de tratamiento enzimático previa con el sistema de enzimas respectivo y separación de los bloques de construcción monoméricos y oligoméricos definidos de las materias primas poliméricas procesadas,

y en el que el sistema de enzimas para liberar arabinosa contiene no más del 50 % de otras actividades enzimáticas,

aparte de la actividad enzimática que produce la liberación de arabinosa de la materia prima polimérica en bruto o procesada según la etapa a) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la materia prima polimérica en bruto comprende al menos el 3 % en peso de lignina, preferentemente el 10 % en peso de lignina, más preferentemente al menos el 20 % en peso de lignina.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el contenido de lignina en la materia prima polimérica, calculado como % en peso de la composición global de la materia prima polimérica, no se reduce durante las etapas a) y b) o su repetición.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que antes de la etapa a) los componentes solubles se separan de la materia prima polimérica en bruto.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema de enzimas usado en la etapa a) contiene preferentemente no más del 10 %, más preferentemente no más del 5 %, más preferentemente no más del 2 %, más preferentemente no más del 1 % de otras actividades enzimáticas, aparte de la actividad enzimática que produce la liberación de dichos bloques de construcción monoméricos u oligoméricos solubles definidos de la materia prima polimérica en bruto insoluble según la etapa a) .

6. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que antes de la repetición de la etapa a) la separación de componentes solubles de la materia prima polimérica procesada se realiza usando una o más etapas de pretratamiento, preferentemente una o más etapas de lavado.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema de enzimas usado en una etapa de tratamiento enzimático particular contiene no más del 10 %, más preferentemente no más del 5 %, más preferentemente no más del 2 %, más preferentemente no más del 1 % de actividades enzimáticas contaminantes, que no se han empleado en una etapa de tratamiento enzimático previa usando un sistema de enzimas diferente o que puede producir liberación de otros bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos, que no se han liberado en etapas de tratamiento enzimático previas, o que pueden solo 65 producir la liberación de productos de sustratos poliméricos que están inicialmente esencialmente ausentes de la materia prima polimérica.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la materia prima polimérica en bruto comprende celulosa y hemicelulosa como sustratos poliméricos y el sistema de enzimas usado en una etapa de tratamiento enzimático particular tiene actividad de celulasa, y opcionalmente actividad de betaglucosidasa, glucohidrolasa y/o alfa-o beta-amilasa, pero está esencialmente libre de actividad de hemicelulasa.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sistema de enzimas usado en una etapa de tratamiento enzimático particular contiene como actividades enzimáticas contaminantes una o más de tales actividades enzimáticas, que se han empleado en una etapa de tratamiento enzimático previa usando un sistema de enzimas diferente o que pueden solo producir la liberación de otros bloques de construcción monoméricos u oligoméricos de sustratos poliméricos que están inicialmente esencialmente ausentes en la materia prima polimérica en bruto; o en el que el sistema de enzimas usado en una etapa de tratamiento enzimático particular tiene una primera actividad enzimática y contiene al menos una actividad enzimática adicional, que conduce al mismo (a los mismos) bloque (s)

de construcción monomérico (s) u oligomérico (s) definido (s) de la materia prima polimérica en bruto o procesada como la primera actividad enzimática del sistema de enzimas, en particular de un sustrato polimérico diferente presente en la materia prima polimérica en bruto.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la materia prima polimérica en bruto insoluble o procesada se somete a una etapa de tratamiento fisicoquímico selectiva o no selectiva antes de la etapa a) o antes de la repetición de la etapa a) según la reivindicación 1.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la etapa de tratamiento fisicoquímico

comprende un tratamiento con disolventes acuosos, disolventes orgánicos, o cualquier combinación o mezclas de 25 estos preferentemente con etanol o glicerol.

12. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que, con el fin de determinar los sistemas de enzimas que van a usarse y su secuencia, la materia prima polimérica en bruto insoluble

a. se trata primero en tratamientos enzimáticos separados con cada uno de una pluralidad de sistemas de enzimas (mezclas) tal como se enumeran en la Tabla 1;

b. para cada tratamiento enzimático los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos liberados de la materia prima polimérica en bruto se analizan para pureza de los bloques de construcción monoméricos u

oligoméricos definidos después de la separación de los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos de la materia prima polimérica en bruto;

c. el sistema de enzimas que da la mayor pureza se elige para la primera etapa de tratamiento enzimático según la etapa a) de la reivindicación 1;

d. la secuencia de etapas a) a c) se repite con el resto de la materia prima polimérica en bruto o procesada con el fin de determinar el sistema de enzimas que va a usarse en la posterior etapa de tratamiento enzimático.

13. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que, con el fin de determinar los sistemas de enzimas 45 que van a usarse y su secuencia, la materia prima polimérica en bruto insoluble

a. se trata primero en tratamientos enzimáticos separados con cada uno de una pluralidad de sistemas de enzimas (mezclas) tal como se enumeran en la Tabla 1 para determinar los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos que contribuyen a la mayor relación másica en la materia prima polimérica en bruto;

b. los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos que contribuyen a la mayor relación másica en la materia prima polimérica en bruto se analizan para pureza después de la separación de la materia prima polimérica en bruto;

c. si la pureza como se determina es de forma que más del 75 % en peso, preferentemente más del 90 % en peso, más preferentemente más del 95 % en peso, más preferentemente más del 99 % en peso, del contenido de sólido total consista en los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos, el sistema de enzimas respectivo se elige para la primera etapa de tratamiento enzimático según la etapa a) de la reivindicación 1;

d. si la pureza determinada según la etapa b) es menos de la requerida según la etapa c) , los bloques de construcción monoméricos u oligoméricos definidos que contribuyen a la siguiente mayor relación másica en la materia prima polimérica en bruto se analizan para pureza después de la separación de la materia prima polimérica en bruto en consecuencia, hasta que una pureza satisface el requisito según la etapa c) y el sistema de enzimas respectivo se elige para la primera etapa de tratamiento enzimático según la etapa a) de la reivindicación 1;

e. opcionalmente, la secuencia de etapas a) a d) se repite con el resto de la materia prima polimérica en bruto o procesada con el fin de determinar el sistema de enzimas que va a usarse en la posterior etapa de tratamiento enzimático.

14. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que, con el fin de determinar los sistemas de enzimas 5 que van a usarse y su secuencia, la materia prima polimérica en bruto a. se trata primero en tratamientos enzimáticos separados con cada uno de una pluralidad de sistemas de enzimas (mezclas) tal como se enumeran en la Tabla 1 para determinar el tratamiento enzimático que conduce al mayor rendimiento de bloques de construcción monoméricos u oligoméricos contenidos en la materia prima polimérica en bruto;

b. seleccionar aquellos tratamientos enzimáticos que dan un producto monomérico u oligomérico definido con una pureza de más del 75 % en peso, preferentemente más del 90 % en peso, más preferentemente más del 95 % en peso, más preferentemente más del 99 % en peso de los sólidos totales;

c. determinar entre los restantes tratamientos enzimáticos el tratamiento con el mayor rendimiento de producto monomérico u oligomérico;

d. opcionalmente, la secuencia de etapas a) a c) se repite con el resto de la materia prima polimérica en bruto o

procesada con el fin de determinar el sistema de enzimas que va a usarse en la posterior etapa de tratamiento enzimático.