Enzimas para el tratamiento de almidón.

Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos,

a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa de Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº.:8 y,

b) donde el módulo de unión a carbohidratos consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos.

Enzimas para el tratamiento de almidón CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una enzima que comprende un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La enzima puede ser un híbrido entre un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y una alfa-amilasa o la enzima puede ser una variante de una enzima progenitora comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y un dominio catalítico de alfa-amilasa. La invención también se refiere al uso de la enzima en un proceso de licuefacción de almidón en el que almidón se degrada en fragmentos más pequeños de oligo- y/o polisacáridos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un gran número de enzimas y procesos se han descrito para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tal como maltosa, glucosa o jarabes de especialidad, bien para uso como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tal como fructosa. Glucosa puede también ser fermentada a etanol u otros productos de fermentación, tales como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona, o eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico; cetonas; aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio) , penicilina, tetraciclina, enzimas, vitaminas, tal como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.

El almidón es un polímero de peso molecular alto que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente 80 % de amilopectina y 20 % de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el que cadenas lineales de residuos de alfa-1, 4 D-glucosa se unen por enlaces alfa-1, 6 glucosídicos.

La amilosa es un polisacárido lineal hecho de unidades de D-glucopiranosa unidas por enlaces alfa-1, 4 glucosídicos. En el caso de la conversión del almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón es despolimerizado. El proceso de despolimerización convencional consiste en un paso de gelatinización y dos pasos de proceso consecutivos, a saber, un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

El almidón granular consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando un compuesto de almidón acuoso se calienta, los gránulos se hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un aumento espectacular en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es de 30-40 % en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que puede ser manejado. Esta reducción en la viscosidad se obtiene hoy principalmente por degradación enzimática. Durante el paso de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades lineales y más pequeñas ramificadas (maltodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se realiza típicamente a aproximadamente 105-110º C durante aproximadamente de 5 a 10 minutos seguidos de aproximadamente a 1-2 horas a aproximadamente 95º C. La temperatura se disminuye luego a 60º C, una glucoamilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa se agregan, y el proceso de sacarificación sigue durante aproximadamente 24 a 72 horas.

Será evidente de la discusión anterior que el proceso de conversión de almidón convencional consume mucha energía debido a los requisitos diferentes en cuanto a temperatura durante los distintos pasos. Es así deseable poder seleccionar y/o diseñar las enzimas usadas en el proceso de modo que el proceso total puede ser realizado sin tener que gelatinizar el almidón. Tales procesos son el sujeto de las patentes US4591560, US4727026 y US4009074 y EP0171218, y la solicitud de patente danesa PA 2003 00949. Kaneko Akihiro et al., 1996 (Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 81, No 4, p. 292-298) describe la secuencia de nucleótidos de un gen que codifica una alfa-amilasa ácida estable derivada de Aspergillus kawachii. Nagasaka, Y. et al., 1995 (Applied Microbiology and Biotechnology, 44 (3-4) : p. 451-458) describe la clonación y la expresión en levadura de la glucoamilasa Athelia rolfsii. La presente invención divulga una nueva enzima híbrida y una modificación genética de una enzima de tipo salvaje diseñada para este tipo de procesos y que comprende una secuencia de aminoácidos de un CBM y una secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de almidón fúngica. Enzimas híbridas son el sujeto de WO9814601, WO0077165 y solicitud de patente danesa PA 2003 00949.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos, a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa ácida Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia mostrada en SEC ID

NO:8; y, b) donde el módulo de unión a carbohidratos tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mencionada antes.

En otros aspectos, la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, una construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un vector; esta célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.

En un sexto aspecto la invención proporciona un método para almidón licuefactante, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular se trata en medio acuoso con la enzima híbrida del primer aspecto de la invención.

En un séptimo aspecto la invención proporciona un proceso preparar un producto basado en masa que comprende la adición de la enzima híbrida del primer aspecto respecto a una masa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El término "almidón granular" se entiende como almidón crudo sin cocer, es decir, almidón que no ha sido sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como gránulos ínfimos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se pone en agua fría, los granos pueden absorber una pequeña cantidad del líquido. Hasta de 50º C a 70º C el hinchamiento es reversible, el grado de reversibilidad depende del almidón particular. Con temperaturas más altas un hinchamiento irreversible llamado gelatinización empieza.

El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima en la que gelatinización del almidón comienza. Almidón calentado en agua empieza a gelatinizar entre 50º C y 75º C; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede determinarse fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según las especies de planta, la variedad particular de las especies de planta al igual que con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura en la que birrefringencia se pierde en 5 % de los gránulos de almidón que usan el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/StÃrke, Vol. 44 (12) pp. 461-466 (1992) .

El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles de los procesos de la invención y puede comprender mono-, di-y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de estas. Preferiblemente al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de los sólidos secos del almidón granular se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

El término "homología" de polipéptido se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia desde la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tal como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970) , Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)... [Seguir leyendo]

1. Enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos,

a) donde el módulo catalítico es una secuencia de alfa-amilasa derivada de la alfa-amilasa de Aspergillus niger y tiene una secuencia de aminoácidos con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº .:8 y, b) donde el módulo de unión a carbohidratos consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº : 25 o un CBM con al menos 90 % de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos.

2. Enzima híbrida de la reivindicación 1, donde la enzima híbrida además comprende una secuencia de aminoácidos de enlace que conecta la secuencia de aminoácidos del módulo catalítico y la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos.

3. Enzima híbrida de la reivindicación 2, donde la secuencia de enlace es una secuencia de enlace seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de enlace de SEC ID Nº : 26, SEC ID Nº : 27, SEC ID Nº : 28, y SEC ID Nº : 29 o una secuencia de enlace que difiere de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº : 26, SEC ID Nº : 27, SEC ID Nº : 28, o SEC ID Nº : 29 en no más de 10 posiciones, no más de 9 posiciones, no más de 8 posiciones, no más de 7 posiciones, no más de 6 posiciones, no más de 5 posiciones, no más de 4 posiciones, no más de 3 posiciones, no más de 2 posiciones, o no más de 1 posición.

4. Secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Construcción de ADN que comprende la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Célula huésped transformada con un vector de expresión según la reivindicación 6, esta célula huésped es capaz de expresar la secuencia de ADN aislada según la reivindicación 4.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, esta célula huésped es de un hongo, una bacteria, una planta o un mamífero.

9. Método para licuefacción de almidón, donde un sustrato de almidón gelatinizado o granular se trata en medio acuoso con la enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3.

10. Método según la reivindicación 9, que comprende el contacto del almidón tratado con una levadura para producir combustible o etanol potable.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende la fermentación del almidón tratado en un producto de fermentación, tal como ácido cítrico, glutamato monosódico, ácido glucónico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona, eritorbato de sodio, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, cetonas, aminoácidos, ácido glutámico (monoglutaminato de sodio) , penicilina, tetraciclina, enzimas, vitaminas, tales como riboflavina, B12, beta-caroteno u hormonas.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 donde el compuesto acuoso de almidón es contactado con un polipéptido que comprende una molécula de unión a carbohidratos, pero no a un módulo catalítico.

13. Proceso para la preparación de un producto a base de masa, que comprende la adición de la enzima híbrida según las reivindicaciones 1 a 3 a una masa.