MINI-ANTICUERPO HUMANO CITOTOXICO PARA LAS CELULAS TUMORALES QUE EXPRESAN EL RECEPTOR ERBB2.

Un anticuerpo anti-ErbB2 de cadena simple recombinante de origen humano capaz de inhibir el crecimiento de células que expresan el receptor ErbB2,

que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2 (región VH) y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:12 (región VL)

Mini-anticuerpo humano citotóxico para las células tumorales que expresan el receptor ErbB2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un mini-anticuerpo humano citotóxico para las células tumorales que expresan el receptor ErbB2, su secuencia correspondiente, el procedimiento para aislarlo, y su uso en terapia.

Estado de la técnica

El receptor de tirosina quinasa transmembrana (RTK) ErbB2, homólogo al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (1, 2), se expresa de forma elevada en carcinomas de mama, ovario y pulmón (3, 4), así como en líneas celulares derivadas de tumores de glándulas salivales y tumores gástricos (5, 6). Su sobreexpresión, que se da habitualmente por medio de amplificación génica, puede alcanzar hasta 2x10⁶ moléculas por célula. En los tejidos normales se expresa a niveles bajos solamente en ciertos tipos de células epiteliales (7). ErbB2 desempeña un papel fundamental en la progresión tumoral, ya que potencia y prolonga las cascadas de transducción de señales provocadas por la activación mediante ligandos de otros receptores RTK ErbB (8). La sobreexpresión de ErbB2 puede incrementar también la resistencia de las células tumorales a las defensas del hospedador permitiendo que eviten la vigilancia inmunológica contra el crecimiento neoplásico ejercida por los macrófagos activados (9). La accesibilidad de ErbB2 en la superficie celular, y su implicación en el desarrollo de la malignidad de estos tumores, hace que sea un objetivo atractivo para la inmunoterapia.

Varios grupos de investigación han aislado anticuerpos monoclonales (mAbs) de ratón y rata dirigidos contra el dominio extracelular de ErbB2 (10-12). Se ha demostrado que algunos de estos mAbs de roedores están dotados de efectos antiproliferativos sobre las células tumorales (10-14). Sin embargo, como consecuencia de su origen no humano, el uso de estos mAbs como fármacos inmunoterápicos es limitado.

Un avance evidente en esta área de investigación consistió en el desarrollo de la técnica de humanización de anticuerpos, con la producción de versiones humanizadas de anticuerpos de roedores (15). Estos mAbs mantienen su especificidad y su afinidad de unión, pero muestran una inmunogenicidad reducida. En particular, se está utilizando una versión humanizada de un anticuerpo murino anti-receptor ErbB2 (Herceptina) como fármaco para el tratamiento del cáncer de mama (16, 17).

Se han aislado fragmentos de anticuerpos (scFv - fragmento variable de cadena simple) de bibliotecas combinatorias expresadas en fagos, usando para la selección antígenos o péptidos purificados inmovilizados en superficies artificiales. La desventaja de este tipo de aproximación es que puede conducir a la selección de anticuerpos que no reconozcan el antígeno en su estado nativo, es decir, en su contexto fisiológico (37). Por ejemplo, un scFv anti-ErbB2 aislado mediante el uso del dominio extracelular de ErbB2 purificado no fue capaz de unirse a ErbB2 en la superficie de células SKBR3 (21).

Al contrario, se ha demostrado que la inmunoadsorción directa (selección mediante afinidad con el antígeno) de un repertorio de scFv con células vivas es esencial para el aislamiento de anticuerpos que reconozcan los antígenos de la superficie celular en su configuración nativa (38). Además, esta estrategia permite la identificación de nuevos antígenos de la superficie celular, que pueden ser útiles en el diagnóstico o la terapia (22, 38-40).

Recientemente ha sido posible aislar scFv completamente humanos mediante la técnica de expresión en fagos. Esta se basa en la expresión de grandes repertorios de dominios de anticuerpos en las cápsides de fagos filamentosos, tras su fusión a la proteína pIII de la cubierta del fago (18, 19). Esta metodología proporciona varias ventajas con respecto a la técnica de hibridomas, que se pueden resumir como sigue: (i) la naturaleza completamente humana de los anticuerpos; (ii) la posibilidad de evitar la inmunización de animales; (iii) el aislamiento rápido de scFv mediante métodos de afinidad a partir de bibliotecas muy grandes de hasta 10¹³ clones diferentes; (iv) la disponibilidad de scFv estables tras la selección de los fagos, con rendimientos elevados mediante la expresión en bacterias de los cADNs seleccionados; (v) la posibilidad de obtener anticuerpos cuando las metodologías clásicas pueden no ser eficaces, como con los antígenos tóxicos o sumamente conservados en diversas especies.

El método de expresión en fagos ya se ha aplicado a la producción de scFv humanos específicos de ErbB2, usando para la selección su dominio extracelular recombinante aislado (20, 21), o más recientemente células de tumores de mama (22). Dada su elevada afinidad por el receptor, estos inmunorreactivos se pueden considerar herramientas valiosas como vehículos de administración para dirigir de manera específica agentes citotóxicos hacia células tumorales que albergan antígenos. Sin embargo, ninguno de ellos tiene actividad antitumoral.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-ErbB2 recombinante de cadena simple de origen humano capaz de inhibir el crecimiento de células que expresan el receptor ErbB2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2 (región VH) y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:12 (región VL).

Otros aspectos y características preferidas de la invención se exponen en las reivindicaciones.

El objetivo de la presente invención es un scFv completamente humano, denominado Erbicina, específico para el receptor ErbB2, con actividad farmacológica, en particular antitumoral. Se ha aislado Erbicina de una biblioteca de fagómidos muy grande (biblioteca Griffin.1) (19) de scFv sintéticos humanos mediante inmunoadsorción (selección por afinidad con el antígeno) llevada a cabo con células vivas que expresan diferentes niveles de ErbB2. Se ha descubierto que el fragmento de cadena simple de un anticuerpo anti-ErbB2 humano, denominado Erbicina, muestra propiedades biológicas que no se han descrito para otros scFv anti-ErbB2 aislados hasta ahora. De hecho, Erbicina se une específicamente al receptor ErbB2, es interiorizada por las células objetivo, inhibe intensamente la fosforilación del receptor, y exhibe una intensa inhibición del crecimiento de todas las líneas celulares ErbB2-positivas analizadas. Además, se puso de manifiesto un efecto citotóxico evidente hacia las células SKBR3 que sobreexpresaban ErbB2, en las que se indujo la muerte apoptótica. Estas características están presentes tanto en Erbicina soluble como en su formato en fagos (Ph-Erbicina).

Otro objetivo de la invención son las composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo Erbicina propiamente dicha en su formato en fagos (Ph-Erbicina), o Erbicina fusionada a las regiones constantes de anticuerpos humanos, o toxinas, o moléculas con potencial citotóxico, tales como enzimas con actividad de ribonucleasa o proteasa (muy conocidas para el experto en este campo). Otro objetivo de la invención es el uso de scFv según la invención en terapia, en particular como agente antitumoral, más en particular para el tratamiento de tumores en los que las células expresan el receptor ErbB2, tales como las células de carcinomas de mama, ovario o pulmón.

Los objetivos adicionales de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Análisis mediante transferencia de Western de extractos celulares preparados a partir de células SKBR3. Los extractos se sometieron a análisis con: scFv expresados en fagos (Ph-Erbicina) (carril 1); mAb MgR6 anti-ErbB2 (carril 2); scFv anti-tiroglobulina expresado en fagos (carril 3). En el carril 4, se sometió a análisis un extracto de células SKBR3, previamente inmunoprecipitado con mAb MgR6 anti-ErbB2, con Ph-Erbicina.

Figs. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E y 2F. Análisis mediante citometría de flujo de la unión de Ph-Erbicina a líneas celulares que expresan ErbB2: MDA-MB453 (la Fig. 2A y la Fig. 2B corresponden a los paneles A y B, respectivamente); BT-474 (la Fig. 2C y la Fig. 2D corresponden a los paneles C y D, respectivamente); SK-OV-3 (la Fig. 2E y la Fig. 2F corresponden a los paneles E y F, respectivamente). Las células se sometieron a análisis con Ph-Erbicina (la Fig. 2A, Fig. 2C y Fig. 2E corresponden a los paneles A, C y E, respectivamente, picos sombreados) o con un scFv anti-NIP de control expresado en fagos (picos sin sombrear). En la Fig....

1. Un anticuerpo anti-ErbB2 de cadena simple recombinante de origen humano capaz de inhibir el crecimiento de células que expresan el receptor ErbB2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2 (región VH) y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:12 (región VL).

2. Un anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en el que la región VH de SEQ ID Nº:2 y la región VL de SEQ ID Nº:12 están unidas de manera covalente mediante un espaciador proteico.

3. Una proteína de fusión caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:2 (región VH) y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº:12 (región VL).

4. Una proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que dichas secuencias de aminoácidos están fusionadas a regiones constantes de anticuerpos humanos, o a toxinas o moléculas con efecto citotóxico.

5. Una proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que dichas regiones constantes de anticuerpos humanos son de inmunoglobulinas G1.

6. Una proteína de fusión según la reivindicación 4 ó 5, cuya proteína es capaz de reconocer específicamente las células tumorales ErbB2-positivas y destruirlas de manera selectiva.

7. Una proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que al menos una de las secuencias está fusionada a una enzima humana con actividad de ribonucleasa.

8. Una proteína de fusión según la reivindicación 7, en la que dicha enzima humana es la ribonucleasa pancreática humana.

9. Las secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo recombinante como se expuso en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o que codifican la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9, que comprende SEQ ID Nº:1 y SEQ ID Nº:11.

11. Un vector que comprende al menos una de las secuencias de nucleótidos según la reivindicación 9 ó 10.

12. Un vector según la reivindicación 11 que es un vector de expresión.

13. Un vector de bacteriófago que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 ó 10.

14. Un vector de bacteriófago según la reivindicación 13, caracterizado porque expresa en su superficie al menos una copia del anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

15. Una célula que está transformada con un vector según la reivindicación 11 ó 12.

16. Un anticuerpo, según la reivindicación 1 ó 2, o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para uso farmacéutico.

17. Un anticuerpo, según la reivindicación 1 ó 2, o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para uso diagnóstico.

18. Un anticuerpo, según la reivindicación 1 ó 2, o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para el uso como un agente antitumoral.

19. Un anticuerpo o una proteína para el uso según la reivindicación 18, en el que el agente antitumoral es antitumoral contra carcinomas de mama, ovario, colon, pulmón, tumores de las glándulas salivales o tumores gástricos.

20. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 ó 10 para uso farmacéutico.

21. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 ó 10 para uso diagnóstico.

22. Un vector de bacteriófago según la reivindicación 13 ó 14 para uso farmacéutico.

23. Un vector de bacteriófago según la reivindicación 13 ó 14 para uso como un agente antitumoral.

24. Un vector de bacteriófago para el uso según la reivindicación 23, en el que el agente antitumoral es antitumoral contra carcinomas de mama, ovario, colon, pulmón, tumores de las glándulas salivales o tumores gástricos.

25. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

26. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un vector según la reivindicación 11 ó 12 o un vector de bacteriófago según la reivindicación 13 ó 14.

27. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25 ó 26 que comprende un diluyente y/o excipiente y/o adyuvante.

28. El uso de un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, para la preparación de un fármaco antiproliferativo o antitumoral.

29. El uso de una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 9 ó 10 para la preparación de un fármaco antiproliferativo o antitumoral.

30. El uso de un vector de bacteriófago según la reivindicación 13 ó 14 para la preparación de un fármaco antiproliferativo o antitumoral.

31. Un procedimiento para la preparación de un anticuerpo recombinante según la reivindicación 1 ó 2, a partir de un vector según la reivindicación 11 ó 12.

32. Un procedimiento para la preparación de una proteína de fusión según la reivindicación 5 que comprende las siguientes etapas: