Microorganismo que presenta una capacidad de producir ácido L-glutámico,

en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen yhfK es potenciada aumentando el número de copias de dicho gen yhfK, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen yhfK, en el que dicho gen yhfK codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº: 2 ó 4; y (B) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº 2 ó 4, en la que dicha proteína incluye sustitución, deleción, inserción o adición de uno a 20 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico, y (C) una proteína que comprende una secuencia aminoácida que presenta el 90% o más de homología con respecto a la secuencia aminoácida total de SEC ID nº: 2 ó 4, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido L-glutámico. El ácido L-glutámico es muy utilizado como un material en bruto para condimentos y así sucesivamente.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El ácido L-glutámico se produce principalmente mediante fermentación, utilizando bacterias que producen ácido L-glutámico, que incluyen las bacterias corineformes que pertenecen al género Brevibacterium Corynebacterium o Microbacterium, o sus cepas mutantes (Kunihiko Akashi et al., Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center), páginas 195-215, 1986). También se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico mediante fermentación, utilizando otros microorganismos, y se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Streptomyces, Penicillium

o similares, en la patente US nº 3.220.929. Se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo perteneciente al género Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida o similares, en la patente US nº 3.563.857. Se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece a los géneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (al que habitualmente se hace referencia como Enterobacter aerogenes)o similares, en JP32-9393B. Procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando una cepa mutante de Escherichia coli se han informado en JP5-244970A. Se ha informado de además, procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia, Pantoea o Enterobacter en US nº 6.197.559, US nº 6.331.419 y en la publicación de patente europea nº 0 999 282).

Además, se han dado a conocer procedimientos para potenciar las actividades de las enzimas biosintéticas del ácido L-glutámico utilizando técnicas del ADN recombinante para aumentar la capacidad de producción del ácido L-glutámico. Por ejemplo, se ha informado de que la capacidad productora del ácido L-glutámico de las bacterias Corynebacterium o Brevibacterium (JP7-121228B) podría potenciarse de forma efectiva introduciendo un gen codificante de la citrato sintasa derivado de Escherichia coli o de Corynebacterium glutamicum. Además, se ha informado asimismo de que la capacidad productora de ácido L-glutámico de las enterobacterias pertenecientes al género Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, o Escherichia (publicación de patente europea nº 0 999 282), podrían mejorar efectivamente introduciendo un gen de la citrato sintasa derivada de una bacteria corineforme.

Resultan conocidos procedimientos para mejorar las capacidades de las bacterias para producir sustancias tales como aminoácidos, modificando un sistema de absorción o de exportación de las sustancias. Como procedimiento para modificar un sistema de absorción para una sustancia, por ejemplo, se sabe de uno para eliminar o reducir la absorción celular de dicha sustancia. Específicamente, se conoce la mejora de la capacidad de producción del ácido L-glutámico eliminando o reduciendo la absorción celular del ácido L-glutámico, borrando (inactivando) el operón gluABCD o una parte suya (publicación de Patente europea nº 1 038 970), o reduciendo la absorción celular de los purínnucleótidos para potenciar la capacidad de producción de ellos (publicación de Patente europea nº 1 004 663).

Los procedimientos para modificar un sistema de exportación incluyen la potenciación de un sistema de exportación de una sustancia diana y eliminar o reducir un sistema de exportación de un intermediario o de un sustrato en un sistema biosintético de una sustancia diana. Por ejemplo, se ha informado de un procedimiento para producir L-lisina utilizando una cepa bacteriana de Corynebacterium en la que la expresión del gen de exportación de la L-lisina (lysE) se potencia (WO97/23597). Además, también se ha informado de un procedimiento para producir un L-aminoácido utilizando un microorganismo en el que la expresión de los genes rhtA, B y C se potencia (publicación de Patente europea nº 1 013 765). Se ha informado de que estos genes están implicados en la exportación de los L-aminoácidos. Como procedimiento para eliminar un sistema de exportación de un intermediario o de un sustrato en un sistema biosintético del ácido L-glutámico, se conoce la mutación o la interrupción del gen de la 2-oxoglutarato permeasa para reducir la exportación del 2-oxoglutarato, que es un intermediario de la biosíntesis del ácido L-glutámico (WO01/05959).

Además, se ha sugerido un procedimiento para la crianza de microorganismos (WO00/37647) en el que el transporte aminoácido a través de la membrana celular es modificado, utilizando un gen que codifica la superfamilia de cassettes de unión al ATP (portador ABC), que está implicado en la penetración de sustancias a través de una membrana celular.

En las bacterias corineformes, se ha informado de que la adición de biotina o de un surfactante cambia la permeabilidad de las membranas celulares, exportándose de este modo el ácido L-glutámico desde el interior celular, lo que sugiere que la exportación del ácido L-glutámico en las bacterias corineformes no es mediado por ningún gen exportador (Eiichiro Kimura, Metabolic Engineering of Glutamate Production, Advanced Biochemical Engineering Biotechnology, 79:37-57, 2003, Springer Verlag). Además, también se ha informado de que la eficiencia de la producción de ácido L-glutámico mejoró en las bacterias Escherichia mejorando la expresión del gen yfiK, que se piensa está implicado en la exportación del L-aminoácido (publicación de Patente europea 1 016 710).

Sin embargo, no se ha informado de un gen exportador del ácido L-glutámico para un microorganismo Pantoea u otros microorganismos, deseándose el descubrimiento de un nuevo gen exportador del ácido L-glutámico.

Alternativamente, se conoce un procedimiento para cultivar un microorganismo para producir y precipitar el ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas (publicación de Patente europea 1 078 989). Bacterias Enterobacter en las que la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa es eliminada o reducida se utilizan a menudo en la producción fermentativa de la precipitación del ácido L-glutámico (publicación de Patente europea 1 078 989).

En general, el ácido L-glutámico se convierte en una etapa en un intermediario del ciclo TCA, el 2-oxoglutarato, mediante la glutamato deshidrogenasa, después de que haya sido importado a las células, y por lo tanto, considerándose generalmente, por lo tanto, que el ácido L-glutámico que se importa a las células es fácilmente metabolizado. Sin embargo, cuando un microorganismo que tiene inactivada o reducida la actividad 2-oxoglutarato deshidrogenasa se cultiva bajo condiciones para la precipitación del ácido L-glutámico, la proporción del ácido L-glutámico libre sin carga eléctrica llega a ser más alta, y atraviesa fácilmente las membranas celulares, da lugar a un aumento en la concentración de ácido L-glutámico intracelular, y a por lo tanto, una disminución en el crecimiento celular bacteriano. En la publicación de patente europea 1 078 989, una cepa deficiente en 2-oxoglutarato deshidrogenasa que puede producir eficientemente y precipitar el ácido L-glutámico, se crió mediante tratamiento mutacional y se utilizó para la preducción del ácido L-glutámico. Sin embargo, se ha informado de algunas cepas distintas a las cepas anteriores que pueden producir ácido L-glutámico mientras también lo precipitan, y no se ha informado de ningún gen que pueda impartir a un microorganismo huésped la resistencia al ácido L-glutámico y la capacidad de producir ácido L-glutámico bajo condiciones que precipiten el ácido L-glutámico.

El gen yhfK es un gen que existe en el genoma de Escherichia coli (Science, 277 (5331):1453-74, 1997), y se ha informado que codifica un portador putativo basado en los motivos, tipología etc., de la secuencia aminoácida predicha (J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2(2):195-198, 2000). Sin embargo, no se ha informado previamente ni de la clonación ni del análisis de la expresión del gen. Además, la función actual del gen permanece desconocida.

Hoischen, C et al, Archives of Microbiology, Berlin, DE, vol 151, nº 4, 1989, páginas 342 a 347, da a conocer un sistema portador de flujo que está implicado en la secreción del glutamato por Corynebacterium glutamicum.

SUMARIO DE...

Reivindicaciones

1. Microorganismo que presenta una capacidad de producir ácido L-glutámico, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen yhfK es potenciada aumentando el número de copias de dicho gen yhfK, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen yhfK, en el que dicho gen yhfK codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

(A) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº: 2 ó 4; y

(B) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº 2 ó 4, en la que dicha proteína incluye sustitución, deleción, inserción o adición de uno a 20 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico, y

(C) una proteína que comprende una secuencia aminoácida que presenta el 90% o más de homología con respecto a la secuencia aminoácida total de SEC ID nº: 2 ó 4, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que dicho gen yhfK es seleccionado de entre el grupo constituido por:

(a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1 o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3; y

b) un ADN que puede hibridizarse a la secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1, o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3, bajo condiciones de astringencia que comprenden el lavado bajo 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68ºC y en el que dicha secuencia codifica una proteína que presenta una capacidad para exportar el ácido L-glutámico.

3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo es una γ-proteobacteria.

4. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho microorganismo es una enterobacteriácea, seleccionada de entre el grupo constituido por Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, y Serratia.

5. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.

6. Procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo de un

- 55 microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio, y la recogida de dicho ácido L-glutámico a partir de dicho medio. 5 --