Micropartículas biocompatibles estables para inmovilización de enzimas y su uso en biosensores amperométricos.

Micropartículas del hidrogel biocompatible p-polietilenglicol metil éter metacrilato (PEGMEM) se utilizan como sistema de inmovilización enzimática para su aplicación como material biológico en el diseño de un biosensor amperométrico.

Las micropartículas se inmovilizan sobre la superficie de un electrodo de platino mediante una membrana de diálisis. La enzima así inmovilizada mantiene su actividad constante durante largos períodos de tiempo, permitiendo su uso como material biológico para la preparación de biosensores amperométricos, los cuáles mantienen su actividad enzimática constante durante al menos 18 meses

Microgeles biocompatibles estables para inmovilización de enzimas y su uso en biosensores amperométricos.

Objeto de la invención y estado de la técnica

En los últimos años se ha producido un intenso desarrollo de materiales basados en polímeros hidrofilicos con nuevas propiedades que ha llevado a la búsqueda de nuevos polímeros o a la modificación de otros conocidos. Son numerosos los trabajos publicados sobre las propiedades de polímeros que contienen grupos hidrofilicos unidos a la cadena principal o presentes en cadenas laterales como es el caso de poli(metacrilatos) con grupos hidroxilo o amino en su estructura (Bayramobreve{g}lu et al., Process. Biochem., 2005, 40, 3505-3513; Kim et al., Anal. Chem., 2005, 77, 6828-6833).

La inmovilización de enzimas en la superficie de un electrodo es un factor clave en la fabricación de biosensores, por esta razón son muchos los métodos de inmovilización ensayados para preparar electrodos enzimáticos amperométricos. Dentro de estos métodos de inmovilización podemos destacar la unión covalente (Kok et al., Biosens. Bioelectron., 2004, 19, 661-665; Kim et al., Anal. Chem., 2005, 77, 6828-6833.), el atrapamiento en matrices (Cai et al., Chem. Mater., 2006, 18, 279-284; Dai et al., Bioelectrochemistry., 2006, 70 (2), 250-256), la adsorción en materiales insolubles (Bayramobreve{g}lu et al., Process. Biochem., 2005, 40, 3505-3513), la conjugación (Konno et al., Biomacromolecules, 2004, 5(2), 342-347), etc. La glucosa oxidasa (GOx), debido a su robustez, es a menudo usada como modelo para probar y desarrollar nuevos sistemas de inmovilización, siendo inmovilizada en diferentes materiales, tales como películas poliméricas (Xian et al., Electrochem. Comunic., 2007, 9 (4), 773-780), geles poliméricos (Wang et al., Langmuir., 2004, 20, 1342-1354) y polímeros conductores (Kuwahara et al., Synth. Met., 2005, 152, 29-35; Tsai et al., Biosens. Bioelectron. 2006 22 (4), 495-500).

La microencapsulación es uno de los sistemas de inmovilización enzimática en el que el biocatalizador queda atrapado dentro de una red tridimensional inerte de un polímero siendo la actividad y la carga enzimática superior a la obtenida por unión covalente o simple adsorción. Los microgeles han resultado ser un medio muy adecuado para la inmovilización por atrapamiento de enzimas y su uso como parte biológica de un biosensor amperométrico enzimático ha dado muy buenos resultados. La estabilidad de la enzima en estas matrices suele ser el factor que determina el tiempo de vida del biosensor, pero además, este sistema de inmovilización presenta ventajas adicionales como su facilidad de manipulación y adaptación a distintos diseños, estabilidad, control del tamaño de poro, así como mayor superficie de contacto entre la enzima y el sustrato. A pesar de estas ventajas, es difícil encontrar en la bibliografía biosensores con enzimas inmovilizadas en micropartículas. En este sentido han surgido derivados vítreos conocidos como "sol-gel" (Gill et al., Trends Biotechnol. 2000,18, 282-296; Andreescu et al., Anal. Chim. Acta. 2002, 464, 171), que debido a su baja conductividad, se han utilizado en el diseño de biosensores ópticos, pero rara vez en los amperométricos, para este fin requieren la adicción de un mediador. Hasta el momento se han propuesto micropartículas de poliacrilamida (Rubio et al., Talanta. 2005, 68 (1), 99-107; Hervás et al. Biosens. Bioelectron., 2006, 22 (3), 429-439), metacrilato (Podual et al., J. Control. Release., 2003, 67 (1), 9-17), alginato (Kim et al., J. Control. Release., 2005, 102 (3), 525-538), líquidos iónicos (Sánchez-Paniagua et al., Biosens. Bioelectron., 2006, 21 (12), 2320-2328), y micropartículas magnéticas porosas (Yu et al., Sens. Act. B, 2006, 113, 749-754; Yu et al., Biosens. Bioelectron., 2007, 22 (11), 2707-2711).

En la patente ES 2246135 se describen partículas de un microgel polimérico - poliacrilamida y poli(ácido acrílico)- con enzima (glucosa oxidasa) inmovilizada en su interior, un procedimiento de síntesis de dichas partículas y su uso en biosensores de glucosa. El biosensor conteniendo estas micropartículas presenta una respuesta constante a la concentración de glucosa durante, al menos, 120 días.

La presente invención se refiere a un material polimérico biocompatible basado en PEGMEM (un ejemplo de la biocompatibilidad de este material se refleja en la patente americana US 7160971, así como por Potoczek et al., Ceram. Int., 2004, 30, 793-799) en forma de micropartículas donde se pueden inmovilizar enzimas. Las enzimas así inmovilizadas presentan una gran estabilidad, de forma que después de 6 meses la actividad de la misma disminuye solamente en un 5% y después de 18 meses la enzima conserva un 85% de su actividad inicial.

Esta extraordinaria estabilidad de las enzimas inmovilizadas en microgeles basados en PEGMEM y su biocompatibilidad hacen que estos microgeles, con enzimas atrapadas en su interior, sean muy útiles como material biológico fijado a la superficie electrónica por una membrana de diálisis en biosensores amperométricos para la determinación de analitos y su aplicación en estudios "in vivo". Los biosensores contiendo microgeles de PEGMEM con glucosa oxidasa atrapada presentan una respuesta constante a la concentración de glucosa durante, al menos, 480 días.

Descripción de la invención

Microgeles biocompatibles estables para inmovilización de enzimas y su uso en bisensores amperométricos.

La presente invención está referida a microgeles biocompatibles, posterior inmovilización enzimática por atrapamiento en dichos microgeles y su uso como material biológico en un biosensor amperométrico que permite la determinación de un analito en disoluciones acuosas.

El biosensor se prepara con micropartículas compuestas por p-PEGMEM en las que la enzima se encuentra en el interior de las micropartículas. La síntesis de las micropartículas se realiza por emulsión concentrada donde la fase continua oleosa está formada por una mezcla de dodecano y Span80. Para obtener la fase dispersa acuosa, se utiliza una disolución tampón de fosfato de sodio en la que se disuelven el monómero PEGMEM, el agente entrecuzante N,N'-metilén-bisacrilamida y el agente iniciador de la reacción polimérica, que en este caso es persulfato de amonio. Finalmente se incorpora la enzima. Para evitar el efecto negativo del oxígeno en la reacción de polimerización, el oxígeno disuelto en la mezcla se elimina por desplazamiento mediante burbujeo de nitrógeno.

Una vez conseguida la emulsión concentrada, de aspecto lechoso, para que comience la polimerización se añade al sistema N,N,N'-trimetil-etilén-diamina que actúa como acelerador de la reacción. Se controla la temperatura de polimerización para asegurarse de que no se sobrepasa la temperatura de desnaturalización de la enzima. El sistema se mantiene en agitación hasta completar la polimerización.

Las partículas de gel se extraen mediante precipitación con una disolución tampón fosfato y posterior centrifugado. Finalmente, las partículas se liofilizan y se conservan en cámara frigorífica.

Las enzimas así inmovilizadas mantienen su actividad constante durante largos periodos de tiempo, permitiendo su uso como material biológico para la preparación de biosensores.

Las medidas de glucosa con el biosensor se llevan a cabo mediante amperometría, en una celda electroquímica termostatizada que consta del biosensor o electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar de platino y un electrodo de calomelanos saturado como electrodo de referencia, midiendo la corriente cuando se alcanza el estado estacionario, a un potencial constante de +0,6V versus ECS, en disoluciones tampón de fosfato sódico pH 6,5.

La cuantificación electroquímica convencional de glucosa incluye un procedimiento basado en la combinación de GOx como enzima y un electrodo para la medida del peróxido de hidrógeno. La enzima GOx oxida selectivamente ß-D-glucosa, como sustrato a D-glucono-d-lactona utilizando oxígeno como mediador electrónico. Este oxígeno se reduce a peróxido de hidrógeno durante la reacción de oxidación por GOx en presencia de oxígeno. Se mide la concentración de peróxido de hidrógeno generado en la reacción enzimática, mediante el electrodo. Esta concentración es...

1. Microgeles biocompatibles caracterizados porque contienen polietilenglicol metil éter metacrilato como monómero y N,N'-metilen-bis-acrilamida como agente entrecruzante y enzimas inmovilizadas en su interior por atrapamiento, manteniendo su actividad durante, al menos, 24 meses después de su preparación.

2. Método de obtención de microgeles biocompatibles con enzima inmovilizada en su interior según reivindicación 1 caracterizado porque utiliza una emulsión concentrada, donde la fase acuosa consiste en una disolución tampón de fosfato de sodio que contiene polietilenglicol metil éter metacrilato (PEGMEM), N,N'-metilen-bis-acrilamida, persulfato de amonio y enzima.

3. Uso de los microgeles biocompatibles con enzima inmovilizada en su interior descritos en la reivindicación 1 como parte de un biosensor para la determinación amperométrica de un analito disuelto en una solución acuosa donde los microgeles se depositan sobre la superficie de un electrodo de platino, formando el material biológico.

4. Uso de los microgeles biocompatibles con enzima inmovilizada en su interior descritos en las reivindicación 1 como parte de un biosensor para la determinación amperométrica de un analito disuelto en una solución acuosa donde los microgeles poliméricos se fijan a la superficie del electrodo de platino modificado por una membrana de diálisis.