METODO PARA LA DETERMINACION SELECTIVA DE PROCALCITONINA 1-116 A EFECTOS DIAGNOSTICOS Y ANTICUERPOS Y KITS PARA EJECUTAR TAL METODO.

Método inmunodiagnóstico para determinar la procalcitonina y los derivados de procalcitonina de efectos diagnósticos,

caracterizado por el hecho de que se determinan selectivamente en una muestra biológica de un pacientes aquellas formas moleculares de la procalcitonina o los péptidos parciales de procalcitonina derivados de las mismas que tienen los aminoácidos alanina y prolina (Ala-Pro AP) en las posiciones 1 y 2 del terminal amino de la procalcitonina 1-116 completa (ID SEC Nº: 1), no siendo la procalcitonina 3-116 que está también presente en la muestra biológica codeterminada y no representando la misma una significativa contribución al valor medido

Método para la determinación selectiva de procalcitonina 1-116 a efectos diagnósticos y anticuerpos y kits para ejecutar tal método.

La invención se refiere al sector de la diagnosis médica, y en particular a la determinación de biomarcadores en fluidos biológicos por medio de métodos inmunodiagnósticos. Más concretamente, la invención se refiere a la determinación del péptido procalcitonina a efectos diagnósticos, determinándose para la procalcitonina 1-116 completa un valor selectivo medido que no era obtenible hasta la fecha y usándose dicho valor en particular para una diagnosis temprana más sensible, para la supervisión del tratamiento y para la supervisión de la progresión de infecciones sistémicas y locales, y en particular de infecciones bacterianas y de sepsis.

En el contexto de la presente invención, expresiones tales como "diagnosis" o "a efectos diagnósticos" se usan como expresión general para determinaciones médicas que pueden surgir de distintos problemas en dependencia del estado clínico del paciente a partir del cual se realiza la determinación y que sirven en particular para la diagnosis y la diagnosis temprana, la determinación de la severidad y la valoración de la progresión, incluyendo la valoración de la progresión como acompañamiento al tratamiento, y la prognosis de la futura de progresión de una enfermedad y la estratificación de pacientes según el riesgo. Aunque en la siguiente descripción se presta particular atención a la mejorada supervisión de la progresión y del tratamiento, no está asociada a la misma limitación alguna de la expresión "a efectos diagnósticos" a tales objetivos diagnósticos específicos.

La prohormona madura procalcitonina (PCT) es un péptido que consta de 116 aminoácidos y del que primeramente se habló como precursor de la importante hormona calcitonina (tireocalcitonina) y cuya secuencia completa de aminoácidos (ID SEC Nº: 1) ha sido conocida desde hace mucho tiempo, como lo han sido los detalles de su degradación proteolítica normal, que conduce a la liberación de la hormona madura calcitonina y otros péptidos más cortos, incluyendo en particular la llamada catacalcina (procalcitonina 96-116) y un péptido N-terminal (N-procalcitonina 1-57), a los que aquí se designa, inter alia, como "péptidos parciales de PCT". Como se explica más exactamente, por ejemplo, en las patentes EP 0 656 121 B1 o US 5.639.617 de la Solicitante y en publicaciones tales como ASSICOT M., GENDREL D., CARSIN H., RAYMOND J., GUILBAUD J., BOHUON C. (1993): High serum Procalcitonin concentrations in patients vith sepsis and infection. Lancet 341:515-518, las infecciones bacterianas severas y ciertas infecciones parasitarias y fungales con una reacción inflamatoria sistémica inducen la liberación de PCT en la circulación, donde la misma se encuentra en muy grandes cantidades que son fácilmente mensurables (véanse por ejemplo también los artículos de resumen en O'CONNOR E., VENKATESH B., LIPMAN J., MASHONGONYIKA C., HALL J. (2201): Procalcitonin in critical illness. Critical Care and Resuscitation 3:236-243; WHICHER I., BIENVENU J., MONNERET G. (2001): Procalcitonin as an acute phase marker. Annals of Clinical Biochemistry 38:483-893; BECKER K. L., NYLEN E. S., WHITE J. C., MUELLER B., SNIDER R. H. (2004): Procalcitonin and the calcitonin gene family of peptides in inflammation, infection and sepsis: a journey from procalcitonin back to its precursors. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 89:1512-1525). Las enfermedades virales, autoinmunes y alérgicas, por otro lado, no conducen a un importante incremento de la concentración de PCT mensurable en la sangre. La PCT refleja la severidad de una infección bacteriana y se usa como marcador para la diagnosis y la supervisión terapéutica de la sepsis, de la sepsis severa y del shock séptico de origen bacteriano (DANDONA P., NIX D., WILSON M.F., ALJADA A., LOVE J., ASSICOT M., BOHUON C. (1994): Procalcitonin increase after endotoxin injection in normal subjects. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 79:1605-1608; GENDREL D., ASSICOT M., RAYMOND J., MOULIN F., FRANCOUAL C., BADOUAL J., BOHOUN C. (1996): Procalcitonin as a marker for the early diagnosis of neonatal infection. Journal of Paediatrics 128:570-573; SNIDER R. H. JR., NYLEN E. S., BECKER K. L. (1997): Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemical characterization. Journal of Investigative Medicine 45:552-560; WHANG K. T., STEINWALD P. M., WHITE J. C., NYLEN E. S., SNIDER R. H., SIMON G. L., GOLDBERG R. L., BECKER K. L. (1998): Serum calcitonin precursors in sepsis and systemic inflammation. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 83:3296-3301; MUELLER B., BECKER K. L., SCHACHINGER H., RICKENBACHER P. R., HUBER P. R., ZIMMERLI W., RITZ R. (2000): Calcitonin precursors are reliable markers of sepsis in a medical intensive care unit. Critical Care Medicine 28:977-983). Se hace expresamente referencia para suplementar la presente descripción a los conocimientos técnicos generales que se exponen en dichas patentes y referencias bibliográficas.

La determinación de PCT puede también usarse a efectos de diagnosis diferencial puesto que, sobre la base de las concentraciones de PCT mensurables en el suero y en el plasma, es posible distinguir las enfermedades inflamatorias basadas en infecciones bacterianas de las que son de etiología no infecciosa (véase también la EP 0 880 702 B1). Esta posibilidad de establecer tal distinción ha demostrado ser muy valiosa para controlar el uso de antibióticos en el tratamiento, por cuanto que es posible evitar la administración de antibióticos también en los casos en los que los mismos no son eficaces porque el paciente no tiene una infección bacteriana.

Ya se han hecho también intentos de determinar la procalcitonina en el caso de infecciones en el fluido cerebroespinal (CSF). En todos los casos que se han descrito en la literatura se empleó un ensayo comercial desarrollado para la diagnosis de sepsis y que tiene una sensibilidad funcional de ensayo (FAS) de solamente 300 ng/l. Los resultados medidos que fueron obtenidos eran contradictorios. Como se describe en la solicitud de patente DE 10 2005 034 174.8 recién publicada o en la WO 2007/009789, sin embargo, pueden obtenerse resultados medidos más significativos si se emplea un ensayo más sensible, que también ha estado disponible desde hace algún tiempo. Con un ensayo de este tipo se obtiene una significativa correlación de la inmunorreactividad de PCT mensurable con la severidad de la enfermedad incluso en el caso de las enfermedades neurodegenerativas. Aunque a continuación no se trata específicamente acerca de la determinación de PCT en el CSF, queda expresamente comprendido dentro del alcance de la presente invención el uso del método según la invención que aquí se describe también en este sector parcial de la diagnosis.

Queda también en principio cubierta por la presente invención una determinación en la orina.

La determinación de PCT se efectúa, como se describe en las patentes y referencias bibliográficas anteriormente mencionadas, de manera adecuada mediante inmunoensayos del tipo sándwich con el uso de dos anticuerpos que se fijan a la secuencia de aminoácidos del péptido PCT completo, con lo cual no se detecta la PCT completamente procesada con liberación de calcitonina pero se detectan la PCT no procesada total y opcionalmente también aquellos péptidos parciales de PCT más largos que siguen teniendo ambos sitios de fijación para los dos anticuerpos que se usan en un ensayo en sándwich dentro de una única molécula, no siendo posible distinguir entre las formas de PCT opcionalmente modificadas terminalmente. Los métodos convencionales emplean dos anticuerpos que en general se fijan a aquellos segmentos del péptido PCT completo que, al tener lugar el procesamiento proteolítico de la PCT con formación de calcitonina, quedan situados en distintos péptidos parciales de PCT de entre los péptidos parciales de PCT que se forman o están situados en péptidos parciales de PCT que no comprenden la secuencia de la calcitonina.

El hecho de que la PCT 1-116 completa (ID SEC Nº: 1) no se encuentre o al menos no se encuentre primariamente en el suero o en el plasma en el caso de la sepsis, sino que en su lugar se encuentre una PCT 3-116 que es más corta en dos aminoácidos (ID SEC Nº: 2), está explicado en la EP 1 121 600 A1 o en la EP 1 408 334 A1 o en la US 6.756.483, a las que se hace referencia para suplementar la presente invención. Se hace además en este contexto referencia a la publicación: WEGLÖHNER W, STRUCK J, FISCHER-SCHULZ C, MORGENTHALER NG, OTTO A, BOHUON C, BERGMANN A:...

1. Método inmunodiagnóstico para determinar la procalcitonina y los derivados de procalcitonina de efectos diagnósticos, caracterizado por el hecho de que se determinan selectivamente en una muestra biológica de un pacientes aquellas formas moleculares de la procalcitonina o los péptidos parciales de procalcitonina derivados de las mismas que tienen los aminoácidos alanina y prolina (Ala-Pro AP) en las posiciones 1 y 2 del terminal amino de la procalcitonina 1-116 completa (ID SEC Nº: 1), no siendo la procalcitonina 3-116 que está también presente en la muestra biológica codeterminada y no representando la misma una significativa contribución al valor medido.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la determinación es realizada usando al menos un anticuerpo que requiere para su fijación específica una secuencia de procalcitonina que tenga al menos uno de los aminoácidos de las posiciones 1 y 2 de la secuencia completa de la procalcitonina 1-116 (ID SEC Nº: 1).

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo requiere para su fijación específica la presencia de ambos aminoácidos de las posiciones 1 y 2 de la secuencia completa de la procalcitonina 1-116 (ID SEC Nº: 1).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo que es al menos uno es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, como por ejemplo un anticuerpo policlonal purificado por cromatografía de afinidad.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que la muestra biológica es un fluido biológico que es seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de sangre y una fracción de sangre, y en particular suero o plasma, y fluido cerebroespinal (CSF).

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de la diagnosis de enfermedades que son seleccionadas de entre los miembros del grupo que consta de infecciones locales o sistémicas, inflamaciones, sepsis y enfermedades neurodegenerativas.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado en la supervisión y el control del tratamiento o en la supervisión de la progresión de una de dichas enfermedades.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que el mismo está diseñado como método inmunocromatográfico para diagnosis en el mismo sitio en que se imparten los cuidados médicos ("point-of-care") o como otro ensayo acelerado.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de una determinación multiparamétrica.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que el mismo es ejecutado como parte de una determinación multiparamétrica mediante el uso de tecnología de chips y/o como parte de un método automatizado con una evaluación asistida por ordenador de los resultados medidos.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que en la determinación multiparamétrica se determina al menos un parámetro adicional relevante para la diagnosis de sepsis.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que el parámetro adicional o los parámetros adicionales que es relevante o son relevantes para la diagnosis de sepsis es seleccionado o son seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de procalcitonina total, procalcitonina 3-116, proteínas CA 125, CA 19-9, S100B, S100A, LASP-1, fragmentos de citoqueratina solubles, y en particular CYFRA 21, TPS y/o fragmentos de citoqueratina-1 solubles (sCY1F), los péptidos inflamina y CHP, las prohormonas pro-ANP, pro-BNP, pro-adrenomedulina, pro-endotelina, pro-vasopresina y sus fragmentos utilizables a efectos diagnósticos, glicina N-aciltrasnferasa (GNAT), carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1), la proteína C-reactiva (CRP) y fragmentos de la misma y de citoquinas.

13. Anticuerpo que se fija selectivamente tan sólo a la procalcitonina 1 a 116 intacta (ID SEC Nº: 1) o a los derivados de procalcitonina que tienen una secuencia de aminoácidos de procalcitonina o una secuencia parcial de aminoácidos de procalcitonina con al menos uno de los aminoácidos 1 y 2, y preferiblemente con ambos aminoácidos 1 y 2, del terminal amino de la secuencia de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1).

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, que es obtenible mediante inmunización de un animal con un antígeno en forma de un conjugado con un péptido que es o comprende un péptido según la ID SEC Nº: 4.

15. Anticuerpo según la reivindicación 13 o 14, que es un anticuerpo monoclonal.

16. Kit para ejecutar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y que, además de los habituales líquidos tampón y de lavado, contiene al menos

- al menos un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 15 en una forma fijada a una fase sólida o en forma marcada o marcable selectivamente y

- un competidor o un compuesto patrón en forma de un péptido que comprende al menos los aminoácidos 1 a 6 de la secuencia de aminoácidos de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1) y que es fijado selectivamente por el anticuerpo que es al menos uno.

17. Kit según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que el competidor está fijado a una fase sólida o está marcado o es selectivamente marcable.

18. Kit para ejecutar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que, además de los habituales líquidos tampón y de lavado y opcionalmente de las sustancias para la detección de señales o la generación de señales, contiene al menos

- un primer anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 15, y

- un segundo anticuerpo que se fija selectivamente a cualquier deseada secuencia parcial de aminoácidos de la procalcitonina 1 a 116 completa (ID SEC Nº: 1) que no comprende los aminoácidos 1 y 2 del terminal de aminoácidos de la procalcitonina.

19. Kit según la reivindicación 18, en el que uno de los dos anticuerpos está presente en una forma fijada a una fase sólida y el otro anticuerpo está presente en forma marcada o selectivamente marcable.

20. Kit según la reivindicación 18, en el que ambos anticuerpos están presentes en una forma adecuada para ser usada como una dispersión en una fase líquida, estando un primer componente de marcación que es parte de un sistema de marcación basado en la extinción o amplificación de fluorescencia o quimioluminiscencia fijado al primer anticuerpo, y estando el segundo componente de marcación de este sistema de marcación fijado al segundo anticuerpo, con lo cual, tras la fijación de los dos anticuerpos al fragmento peptídico a detectar, es producida una señal mensurable que permite la detección de los resultantes complejos en sándwich en la solución de medición.

21. Kit según la reivindicación 20, en el que el sistema de marcación comprende criptatos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante de fluorescencia o quimioluminiscencia, en particular del tipo cianina.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, comprendiendo también el kit, como componente adicional, un compuesto para estabilizar la muestra biológica inhibiendo la acción enzimática de la dipeptidilaminopeptidasa IV (DAP IV; DP IV; CD 26).