METODO PARA ENSAYAR LA REPLICACION DE HBV Y PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A FARMACOS.

Un método para medir la capacidad de replicación de HBV, por ejemplo HBV presente en una muestra biológica,

posiblemente en la presencia de un producto farmacéutico, preferiblemente un agente antivírico, el método comprende:

(a)posiblemente extraer ácidos nucleicos contenidos en la muestra biológica;

(b)amplificar por PCR ácidos nucleicos de HBV que utilizan por lo menos dos pares de cebadores seleccionados con el fin de obtener por lo menos dos diferentes fragmentos genómicos de HBV amplificados que luego de ensamble representa una secuencia de ADN continua lineal que se puede transcribir en pgARN;

(c)clonar los fragmentos obtenidos bajo (b) en un vector bajo el control de un promotor heterólogo, con el fin de producir un vector que contiene una secuencia de ADN continua lineal que se puede transcribir en pgARN bajo el control de dicho promotor,

(d)transfectar o transducir células susceptibles con el vector;

(e)cultivar las células transfectadas o transducidas en condiciones que permiten la síntesis de pgARN del HBV del ADN del HBV clonado;

(f)posiblemente tratar las células cultivadas con el producto farmacéutico, en particular agente antivírico; y

(g)determinar la capacidad de replicación de the HBV, posiblemente la incidencia del producto farmacéutico, preferiblemente agente antivírico, en la expresión de gen vírico y/o replicación vírica,

en donde en uso en la etapa (b) se hace de un cebador par de acuerdo con la reivindicación 32 y un cebador par de acuerdo con la reivindicación 33

Método para ensayar la replicación de HBV y prueba de susceptibilidad a fármacos.

La presente invención se relaciona con la clonación de genomas de ADN del HBV competentes para replicación, con métodos para medir la capacidad de replicación del HBV, por ejemplo HBV presente en una muestra biológica, posiblemente en la presencia de un producto farmacéutico, en particular un agente antivírico. La invención se relaciona en particular con ensayos fenotípicos que permiten probar la susceptibilidad del HBV a fármacos o para detectar fármacos en HBV.

Más particularmente, la invención se relaciona con tales métodos para determinar la susceptibilidad de las cepas víricas presentes en un paciente a los fármacos disponibles y por lo tanto adaptar una terapia antivírica a la situación virológica.

La invención también se relaciona con cebadores, pares de cebadores y equipos utilizados en la amplificación, así como también con vectores que comprenden células y genomas de ADN del HBV competentes para replicación, por ejemplo estirpes celulares transfectadas con tales vectores.

A pesar del desarrollo de una vacuna eficiente, la infección por el virus de la hepatitis B crónica (HBV) todavía es un problema importante de salud pública en todo el mundo. De hecho, más de 400 millones de personas son portadores crónicos del virus y están en alto riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.

El HBV es un virus de ADN que replica su genoma a través de una fase de transcriptasa inversa. El índice de error espontáneo de la transcriptasa inversa vírica lleva a la heterogeneidad del genoma del HBV. Para ilustrar este último punto, se han identificado ocho genotipos (A a H), y se han descrito los mutantes del HBV que se seleccionan durante el curso natural de la infección o durante la terapia.

Recientemente, se han logrado importantes progresos en el campo de la terapia antivírica de la hepatitis B crónica, con el desarrollo de análogos de nucleósidos que inhiben la polimerasa vírica. Por lo tanto, la lamivudina se ha aprobado desde hace dos años y ahora es muy utilizada en la práctica clínica en todo el mundo. Aunque esto inhibe de manera significativa la replicación del virus, se observa la emergencia de mutantes resistentes a los fármacos que alojan mutaciones en dominios conservados de la polimerasa vírica con una prevalencia en del paciente, que incrementa de 15 en un año a 75% en los cuatro años de terapia. Como estos mutantes pueden representar una nueva amenaza para la salud humana, se necesitan nuevos agentes antivíricos para combatirlos. Así, otros inhibidores, tales como el adefovir dipivoxil, entecavir, emtricitabina, clevudina y telbivudina, se han estudiado recientemente por sus propiedades anti-HBV en modelos experimentales y se evalúan actualmente en ensayos clínicos. Sin embargo, los estudios in vitro también han mostrado que las cepas resistentes a lamivudina pueden tener resistencia cruzada a algunos de estos fármacos (por ejemplo, emtricitabina), mientras que son sensibles a otros. Esta observación merece un estrecho control de la población vírica en vivo y un énfasis en el desarrollo de ensayos resistentes a fármacos (o ensayo fenotípico).

Por lo tanto, será importante en el futuro, en el ámbito clínico, conocer en cada paciente la susceptibilidad de las cepas víricas a los fármacos disponibles y por lo tanto adaptar la terapia antivírica a la situación virológica.

Hasta la fecha, no se ha desarrollado eficiencia del ensayo de susceptibilidad de fármaco fenotípico a para el HBV. Con el desarrollo actual y futuro de las nuevas moléculas anti-HBV, las pruebas de susceptibilidad de fármaco fenotípicas deben convertirse en una cuestión importante para el manejo del paciente infectado con aislados del HBV resistentes.

El mecanismo de entrada del HBV en las células no se ha aclarado completamente. Después de retirar la envoltura, el ADN del HBV se pone en el núcleo de la célula anfitriona, donde se repara a la forma circular cerrada covalentemente (cccADN). Una vez se hace recircular, las actividades mejoradoras y promotoras comienzan a producir las diferentes transcripciones de ARN del HBV. Hay transcripciones sub-genómicas que sirven como mARN para la expresión de la X y las proteínas de superficie. Las transcripciones genómicas más grandes son más largas de un genoma de longitud y sirven para producir e, núcleo y proteínas de polimerasa, y una transcripción genómica particular, la falta del codón de inicio ATG para la proteína e, se designa al ARN pregenómico (pgARN). Este pgARN, que es la plantilla para la síntesis del ADN del HBV mediante trascripción inversa, es más largo que un genoma de longitud (es decir, pax 1.1 unidad de genoma) y por lo tanto contiene una hebra de ARN redundante terminalmente. La secuencia redundante comprende aproximadamente 200 nucleótidos, que incluyen repetición directa 1 (DR1), así como también la horquilla. Ver para más información, G-H Wang et al., hbox{Cell 1992, 71: 663-670, G-H Wang et al., J. Virol. 1993, 67: 6507-6512).}

Al estudiar los mutantes del HBV in vitro, se utilizan los vectores plasmídicos que contienen la información genómica requerida para la iniciación de la replicación del HBV en las células después de la transfección; tales plásmidos son competentes para replicación. Estos plásmidos contienen 1.1 a 2 genomas del HBV. Los métodos clásicos para estudiar los mutantes se basan en mutagenia dirigida al sitio de construcciones de HBV competentes para replicación bien establecidas (cepas de laboratorio solamente, no clínicas) o en la introducción de fragmentos del genoma del HBV (es decir, "intercambio de casete") de aislados clínicos en las construcciones de HBV competentes para replicación (ídem). La transferencia mediada por PCR de casetes de genoma HBV o en la mutagenia dirigida a sitio en una cepa de laboratorio competente para replicación bien establecida permitida por ejemplo, confirmar que algunos mutantes seleccionados en pacientes in vivo durante la terapia antivírica de hecho confieren resistencia a lamivudina (Seigneres B., et al., Hepatology 2002, 36: 710-722; Pichoud C. et al., Hepatology 1999, 29: 230-237; Allen M.I. et al., Hepatology 1998, 27: 1670-1677; Bock C.T. et al., Gastroenterology 2002, 122: 264-273). Sin embargo, estos métodos no permiten estudiar la información genética del HBV completa a partir de los aislados clínicos y puede por lo tanto excluir algunas mutaciones importantes situadas en otras partes del genoma o resulta en genomas del HBV de mosaico.

Günther et al (J. Virol. 1995, 69, 9: 5,437-5,444) ha descrito primero un método para la amplificación por PCR de genomas de HBV de longitud completa (es decir, una unidad de genoma) que tiene por objeto facilitar el análisis de los aislados HBV naturales. El amplicón de longitud completa se utiliza directamente para experimento de transfección de estirpes o células clonadas de tumor hepático antes de su uso. Ambos métodos involucran la utilización de la enzima de restricción Sap-I (Desde New England Biolabs), que es una enzima de restricción bastante cara e ineficiente. El genoma de longitud completa transfectado se hace circular en el núcleo de las células por las enzimas del anfitrión (que permanecen para ser identificadas) para dar lugar a ADN circular covalentemente cerrado del HBV, que es la plantilla natural para la transcripción de los genes del HBV. En este caso el promotor de HBV endógeno se utiliza para la trascripción. El mismo método se utiliza en S. Günther et al., J. Clin. Microb 1998, 36, 2: 531-538). El proceso de circularización mediada por anfitrión de ADN del HBV lineal es altamente ineficiente y por lo tanto representan una limitación principal para el análisis de todos los mutantes del HBV. Debido al bajo nivel de plantilla circular de HBV generada se obtiene un bajo nivel de la síntesis del ADN del HBV (replicación). Este bajo nivel de la síntesis de ADN del HBV impide el análisis de la replicación vírica y la prueba de susceptibilidad a fármaco. Otras limitaciones del método de Günther son la gran cantidad de productos de amplificación que son necesarios para la transfección de células, y la ausencia de una fuente continua "fácil de usar" de material para transfecciones celulares y estudios fenotípicos. Aunque es interesante para la investigación fundamental, este método no parece apropiado en el contexto de un ensayo fenotípico estándar que requiere el nivel de replicación de sólido y la producción de cantidad fácilmente...

1. Un método para medir la capacidad de replicación de HBV, por ejemplo HBV presente en una muestra biológica, posiblemente en la presencia de un producto farmacéutico, preferiblemente un agente antivírico, el método comprende:

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ADN continua comprende nucleótidos de HBV (de 5' a 3'):

- una unidad de aproximadamente 1 genoma que parte en 5' de y que incluyen el nucleótido que representa el +1 de trascripción al primer nucleótido en 5' del ATG del gen pre-C, más

- un fragmento subgenómico que parte de y que incluye el A del ATG del gen pre-C y que se extiende a y que incluye el sitio de adhesión poliA,

en donde la secuencia de ADN continua lineal no comprende en su extremo 5' el ATG del gen pre-C.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de ADN continua comprende de 5' a 3' nucleótidos 1818 10 a 1813 y 1814 a 1960 de una secuencia genómica HBV alineada con la secuencia como se establece en GenBank AB048704.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de ADN continua comprende de 5' a 3' nucleótidos 1816 a 1813 y 1814 a 2016 de una secuencia genómica HBV alineada con la secuencia como se establece en GenBank AB048704.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde en la etapa (b), el uso se hace de un primer par cebador y de un segundo par cebador, que comprende cada uno un cebador directo y un cebador inverso diseñado para amplificar respectivamente:

- un primer fragmento que comprende una secuencia de ADN del HBV que comprende en su extremo 5' el nucleótido que representa el +1 de la trascripción

- un segundo fragmento que comprende una secuencia de ADN del HBV que comprende en su extremo 3' el sitio de adhesión poliA

el extremo 3' del primer fragmento y el extremo 5' del segundo fragmento se superponen y preferiblemente comprende un sitio de restricción en la parte superpuesta.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el primer par cebador comprende un cebador directo A que es parcialmente complementario a la parte 5' del gen pre-C, que incluye el nucleótido que representa el +1 de trascripción, pero no contiene el ATG del gen pre-C.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde este cebador directo A comprende un sitio de restricción que no está presente en el genoma HBV.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde este cebador directo A comprende un sitio de restricción escogido entre NotI, AscI, PacI. PmeI y SSe8387I.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde este cebador directo A comprende una secuencia como se establece en una cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 12.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el primer par cebador comprende un cebador inverso B que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 13 o 14, o una mezcla de dos cebadores inversos B que comprenden una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde el segundo par cebador comprende un cebador directo complementario a una región de ADN del HBV que está en 5' con respecto a tal complementariedad con el cebador inverso del primer par cebador.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cebador directo del segundo par cebador y el cebador inverso del primer par cebador son complementarios a las regiones genómicas HBV que se superponen y comprenden un sitio de restricción natural único.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el cebador directo del segundo par cebador y el cebador inverso del primer par cebador comprenden un sitio NcoI que es complementario al sitio NcoI natural único.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el cebador directo comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 15 o 16, o es una mezcla de dos cebadores que comprenden una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, en donde el segundo par cebador comprende un cebador inverso D diseñad para ser complementario con una región del genoma HBV que está en 3' del sitio de adhesión poliA.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el cebador inverso D comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 17 o 18, o es una mezcla de dos cebadores D que comprenden una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el uso se hace de cebadores complementarios a regiones genómicas HBV que se conservarán bien entre HBV.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la amplificación involucra de 20 a 60, en particular de 30 a 50, preferiblemente aproximadamente 40 ciclos.

19. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde los fragmentos d HBV amplificados se clonan en un vector en un procedimiento clónico de una etapa.

20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el +1 de trascripción del promotor heterólogo se fusiona al +1 de trascripción del fragmento HBV.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el promotor se escoge entre el grupo que consiste de promotor CMV-IE, promotor de gen C de ubiquitina humano, el promotor del gen EF-1a, los promotores tempranos y tardíos del virus SV40, el promotor LTR del virus sarcoma de Rous, promotores de gen de citoesqueleto.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el promotor es el promotor desmina o el promotor actina.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el promotor es el promotor ß-actina de pollo.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 o 23, en donde la secuencia de ADN obtenida en la etapa (c) está bajo el control del promotor de ß-actina y el mejorador CMV-IE.

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde en la etapa (d), las células son células eucarióticas, preferiblemente de origen de hepatocito, preferiblemente estirpes celulares tales como células de tumor hepático.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde las células se transfectan directamente con el vector.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el vector se transfiere en el baculovirus y luego se transducen las células con el baculovirus.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el vector se transfiere en una estirpe celular para producir una estirpe celular estable que expresa constitutivamente HBV.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en donde en la etapa (f), el agente antivírico es lamivudina, adefovir dipivoxil, entecavir, emtricitabina, clevudina, telbivudina, tenofovir, beta-L-FD4C o cualesquier combinaciones de los mismos.

30. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en donde en la etapa (f), una molécula se prueba como un agente antivírico potencial.

31. El polinucleótido útil como cebador para amplificación HBV, que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 18.

32. El par cebador para amplificación HBV que comprende un cebador directo que comprende (1) una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12, y (2) un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14 o una mezcla de un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 13 y un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 14.

33. El par cebador para amplificación HBV que comprende (1) un cebador directo que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. o una mezcla de un cebador directo que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 15 y un cebador directo que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 16, y (2) un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18 o una mezcla de un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 17 y un cebador inverso que comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 18.

34. Equipo para amplificación HBV, que comprende un cebador par de acuerdo con la reivindicación 32 y un cebador par de acuerdo con la reivindicación 33.