Un método in vitro para seleccionar marcadores biológicos específicos para una enfermedad que sean accesibles a partir del espacio extracelular en tejidos patológicos para ligandos de alta afinidad que comprende las etapas de:

- inmersión de una muestra de tejido nativo normal en una solución que contiene un reactivo de marcación para etiquetar proteínas; en donde proteínas accesibles son marcadas por medio del reactivo de marcación; -inmersión de una muestra de tejido nativo patológico en una solución que contiene un reactivo de marcación para etiquetar proteínas, en donde proteínas accesibles son marcadas por medio del reactivo de marcación; -purificación por separado de las proteínas marcadas de cada una de las muestras; -análisis de las proteínas marcadas o de fragmentos de las mismas de tejido normal y tejido patológico, respectivamente; -determinación del patrón de expresión diferencial de las proteínas marcadas en las muestras de tejido nativo patológico comparadas con las muestras de tejido normal; -juzgar que la(s) proteína(s) marcada(s) que tiene(n) mayor expresión en la muestra de tejido nativo patológico comparada con la muestra de tejido normal o que es expresada más frecuentemente en muestras respectivas de tejido nativo patológico comparadas con la muestra de tejido normal sea/sean marcador(es) biológico (s) para tejido patológico, que son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular

MÉTODO IN VITRO PARA SELECCIONAR MARCADORES BIOLÓGICOS ACCESIBLES EN TEJIDOS PATOLÓGICOS DESCRIPCION

La presente invención se refiere a un método in vitro para seleccionar marcadores biológicos de enfermedades específicas accesibles a partir del espacio extracelular en tejidos patológicos.

El descubrimiento de marcadores biológicos clínicamente adecuados para la detección precisa y el tratamiento selectivo de enfermedades representa un reto médico importante. La selección de los tejidos patológicos sin afectar a sus contrapartes normales es uno de los enfoques más prometedores para mejorar la eficiencia y seguridad del tratamiento (Wu, A. M. & Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nat Biotechnol 23, 1137 -1146 (2005); Adams, G. P. & Weiner, L. M. Monoclonal antibody therapy of cancer. Nat Biotechnol 23, 1147 -1157 (2005); Carter, P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nat Rev Cancer 1, 118 -129 (2001)). Indiscutiblemente, tales avances representarían un gran adelanto para la terapia del cáncer y otras enfermedades. Por lo tanto, la identificación de marcadores biológicamente válidos incluidas las proteínas específicamente expresadas en tejidos enfermos, ha sido de suma importancia (Hortobagyi, G. N. Opportunities and challenges in the development of targeted therapies. Semin Oncol 31, 21 -27 (2004); Neri, D. & Bicknell, R. Tumour vascular targeting. Nat Rev Cancer 5, 436 -446 (2005)). A pesar de todo, incluso el más reciente descubrimiento de estrategias de selección basadas en el estado de la técnica, las tecnologías de alto rendimiento no habían abordado la limitación, en tejidos humanos, de la accesibilidad del antígeno a ligandos adecuados de alta afinidad tales como anticuerpos monoclonales humanos enlazados a moléculas bioactivas (Adams, G. P. & Weirder, L. M. Monoclonal antibody therapy of cancer. Nat Biotecfinol 23, 1147 -1157 (2005); Neri.

D. & Bicknell, R. Tumour vascular targeting. Nat Rev Cancer 5, 436 -446 (2005).

La identificación de marcadores biológicos únicos para procesos patológicos específicos sería más valiosa para la detección precisa (por ejemplo por medio de estudios de imágenes) y terapia selectiva de enfermedades incluido el cáncer. Por ejemplo, los pacientes que sufren de cáncer ciertamente se beneficiarían de tales desarrollos. En realidad, agentes quimioterapéuticos, usualmente diseñados para tomar ventaja de características de las células tumorales tales como las altas tasas de proliferación, infortunadamente también se dirigen a células de ciclo normal incluidos progenitores hematopoyéticos. El suministro dirigido de estos fármacos y de otras moléculas bioactivas (por ejemplo radioisótopos, citoquinas) al microambiente del tumor (por ejemplo proteínas expresadas específicamente en el compartimiento estromal o vascular del tumor) por medio de moléculas de enlazamiento tales como anticuerpos humanos recombinantes, representaría una considerable mejoría terapéutica. Esta estrategia selectiva incrementaría la cantidad de fármacos que alcanzan el tumor con poca o ninguna toxicidad para los tejidos sanos del huésped. El reciente desarrollo de tecnologías proteómicas de alto rendimiento tales como la espectrometría de masas han facilitado la identificación rápida y precisa de mezclas de muestras biológicas complejas pero pequeñas, venciendo muchas limitaciones de la electroforesis bidimensional en gel para análisis del proteoma (Peng, J. & Gygi, S.

P. Proteomics: the move to mixtures. J Mass Spectrom 36, 1083 -91 (2001)) y haciendo más fácil que nunca la identificación la identificación de objetivos. El reciente desarrollo de esta tecnología proteómica de alto rendimiento representa una gran promesa para acelerar el descubrimiento de nuevos objetivos, notablemente en investigación sobre el cáncer. Por ejemplo, se ha utilizado recientemente espectrometría de masas en tándem de escopeta libre de gel para comparar perfiles globales de expresión de proteína en líneas de células cancerosas y normales epiteliales mamarias

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humanas (Sandhu, C. y colaboradores, Global protein shotgun expression profiling of proliferating mcf-7 breast cancer cells. J Proteome Res 4, 674 -89 (2005)). Infortunadamente, un escollo significativo asociado con tal aproximación es que no proporciona pistas en cuanto a si las proteínas de interés son accesibles a ligandos adecuados de alta afinidad, tales como anticuerpos monoclonales suministrados sistémicamente, en tejidos humanos. En realidad, proteínas específicas, todavía pobremente accesibles expresadas en tejidos patológicos se espera que sean de escaso valor para el desarrollo de terapias contra el cáncer con base en anticuerpos. Las estrategias que revelarían marcadores biológicos de enfermedades no solamente específicamente expresados en tejidos patológicos sino también accesibles a partir del fluido extracelular ayudarían a vencer esta limitación.

Además, se conocen métodos que permiten la marcación de proteína ya sea por medio de perfusión terminal in vivo o por medio de perfusión ex vivo de órganos patológicos humanos. Sin embargo, la técnica de perfusión está restringida a animales experimentales (por ejemplo roedores) u órganos resecados quirúrgicamente vascularizados por una arteria cateterizable (por ejemplo de riñón), que excluye muchos tipos de tejidos patológicos de investigación, a saber aquellos que no pueden ser sometidos a perfusión.

El documento Busch y colaboradores (European Journal of Cell Biology, vol. 50, no. 2, páginas 257 -262 (1989)) se refiere al aislamiento selectivo de las proteínas de la superficie de la célula del cultivo de tejido por medio de una etiqueta escindible de biotina. Como se describió, se incubaron eritrocitos o hepatocitos aislados con una biotina etiquetada.

El documento Scheurer y colaboradores (Proteomics 2005, vol. 5, no. 12, páginas 3035 3039) divulga un método similar para etiquetar proteína de la superficie de la célula utilizando un reactivo de biotinilación. Tal como se describe, se recogieron las células y se las utilizó para marcación.

El documento De La Fuente y colaboradores (American Journal of Physiology, vol. 272, no: 3, parte 1, páginas L461-L470 (1997)) se refiere a la marcación de proteínas de la membrana. Se utiliza ya sea perfusión de un animal o marcación de un homogenato para este método.

El documento Rybak y colaboradores (Nature Methods, vol. 2, no.4, 291 -298 (2005)) describe un método para la biotinilación de identificación de antígenos específicos del órgano que son accesibles a partir de la vasculatura. El método descrito hace uso de una etapa de "perfusión terminal" de un animal. En un método alternativo descrito en este documento, se utiliza un procedimiento de perfusión ex vivo de órganos.

El documento WO 01/71359 A2 se refiere a métodos para etiquetar y aislar polipéptidos expuestos al lumen que se expresan sobre el costado de células luminal, vasculares, de conductos y otros espacios de tejido que pueden someterse a perfusión. El método hace uso de una etapa de administración de un reactivo marcado en el espacio que puede ser sometido a perfusión en un órgano intacto o un animal intacto. Como se describe en este documento, los métodos incluyen la administración del reactivo en el espacio que puede ser sometido a perfusión del órgano intacto o tejido o el animal intacto por medio de la administración del reactivo; en particular los métodos descritos hacen uso de perfusión de la muestra.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención era el de suministrar un nuevo método, simple, rápido y eficiente para identificar, en tejidos humanos originados a partir de biopsias y de órganos que no pueden ser sometidos a perfusión (por ejemplo lesiones cancerosas presentes en especímenes de mastectomía o prostatectomía radical), marcadores biológicos de enfermedades específicas accesibles a partir del espacio extracelular.

3 El objetivo se resuelve mediante un método in vitro para seleccionar marcadores biológicos específicos para una enfermedad que son accesibles a partir del espacio extracelular en tejidos patológicos para ligandos de alta afinidad que comprende las etapas de: -inmersión de una muestra de tejido nativo normal en una solución que contiene un reactivo de marcación para etiquetar proteínas; en donde proteínas accesibles son marcadas por medio del reactivo de marcación; -inmersión de una muestra de tejido nativo patológico...

1. Un método in vitro para seleccionar marcadores biológicos específicos para una enfermedad que sean accesibles a partir del espacio extracelular en tejidos patológicos para ligandos de alta afinidad que comprende las etapas de:

- inmersión de una muestra de tejido nativo normal en una solución que contiene un reactivo de marcación para etiquetar proteínas; en donde proteínas accesibles son marcadas por medio del reactivo de marcación; -inmersión de una muestra de tejido nativo patológico en una solución que contiene un reactivo de marcación para etiquetar proteínas, en donde proteínas accesibles son marcadas por medio del reactivo de marcación; -purificación por separado de las proteínas marcadas de cada una de las muestras; -análisis de las proteínas marcadas o de fragmentos de las mismas de tejido normal y tejido patológico, respectivamente; -determinación del patrón de expresión diferencial de las proteínas marcadas en las muestras de tejido nativo patológico comparadas con las muestras de tejido normal; -juzgar que la(s) proteína(s) marcada(s) que tiene(n) mayor expresión en la muestra de tejido nativo patológico comparada con la muestra de tejido normal o que es expresada más frecuentemente en muestras respectivas de tejido nativo patológico comparadas con la muestra de tejido normal sea/sean marcador(es) biológico (s) para tejido patológico, que son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular.

2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde se juzga que la(s) proteína(s) marcada(s) que tiene(n) expresión en la muestra de tejido patológico nativo pero que no es/son expresada(s) o esencialmente no expresada(s) en el tejido normal es/son marcador(es) biológico(s) para tejido patológico, que son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular, preferiblemente son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular en tejido nativo, más preferiblemente son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular in vivo.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, en donde el reactivo de marcación para marcación de proteínas es una biotina reactiva, preferiblemente un derivado de éster reactivo de biotina.

4. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa de purificación hace uso de la etiqueta de las proteínas marcadas como marcador selectivo.

5. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la etiqueta es un residuo de biotina y en donde la purificación se lleva a cabo utilizando estreptavidina enlazada a una resina, en donde las proteínas marcadas con biotina están enlazadas a la resina a través de estreptavidina.

6. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde después de la etapa de purificación se escinden las proteínas marcadas hasta péptidos, preferiblemente por medio de digestión proteolítica.

7. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa de análisis incluye espectrometría de masas, preferiblemente microsecuenciación por medio de espectrometría de masas en tándem.

8. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la muestra de tejido patológico nativo se deriva de tejidos seleccionados del grupo que consiste de tejido

39 tumoral, tejido inflamado, tejido ateromatótico o resultante de enfermedades degenerativas, metabólicas y genéticas.

9. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la accesibilidad de los marcadores biológicos se refiere a ser accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular en tejido nativo.

10. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde marcadores biológicos para enfermedades patológicas que no son accesibles para ligandos de alta afinidad del espacio extracelular en una muestra de tejido nativo no serán o esencialmente no serán marcados.

11. El método de acuerdo a la reivindicación 9 ó 10, en donde se seleccionan los ligandos de alta afinidad del grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, fármacos, prodrogas, ligandos, biotina, y derivados y conjugados de los mismos, preferiblemente conjugados de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpo con fármacos o prodrogas.

12. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde los marcadores biológicos son proteínas o polipéptidos, que son expresados en el tejido patológico dado y no expresados en el tejido normal, o son expresados en mayor nivel en el tejido patológico dado que en el tejido normal, en donde el marcador biológico indica una condición patológica comparada con la condición fisiológica normal del correspondiente tejido normal.