Método para modificar un material de sustrato mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente activo en dicho sustrato,

por lo cual el cultivo bacteriano no es susceptible al ataque por bacteriófagos, el método comprendiendo

(i) aislar una cepa bacteriana que no es capaz de replicación de ADN en dicho material de sustrato pero es capaz de modificar metabólicamente el material de sustrato, en donde la cepa bacteriana es una cepa mutante que es auxotrófica con respecto a un compuesto que no está presente en el material de sustrato y que es requerido por la cepa para la replicación de ADN,

(ii) propagar la cepa seleccionada en un medio en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un cultivo de dicha cepa,

(iii) añadir el cultivo bacteriano obtenido al material de sustrato y mantener el material bajo condiciones donde el cultivo es metabólicamente activo,

por lo cual, si el material de sustrato está contaminado con un bacteriófago, la actividad metabólica del cultivo bacteriano está sustancialmente sin afectar por el bacteriófago, y en donde el cultivo bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp. Strepococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. Micrococcus spp., Bacillus, spp., Actinomycetes spp., Corynebacteríum spp. y Brevibacterium spp; y en donde el material de sustrato es un material iniciador para un producto comestible, el material es seleccionado del grupo que consiste en leche, un material vegetal, un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino, una masa y un rebozado; y en donde el cultivo bacteriano conforme es obtenido en el método se usa como un cultivo iniciador en la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto alimenticio y un producto de pienso

Método de prevención de infección bacteriófaga de cultivos bacterianos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de cultivos bacterianos que se usan industrialmente en la fabricación de p. ej. productos alimenticios o productos de metabolito útiles. En particular se proporcionan cepas bacterianas modificadas, que, cuando son cultivadas en un material de sustrato seleccionado, no son susceptibles al ataque por bacteriófagos, y han retenido su capacidad de ser metabólicamente activas.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

Los fallos de producción de cultivos bacterianos provocados por infección por bacteriófagos se consideran como uno de los problemas más importantes en el uso industrial de cultivos bacterianos. Los bacteriófagos se han encontrado para muchas de las cepas bacterianas usadas en la industria, tal como especies de bacterias del ácido láctico p. ej. Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., y Estreptococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. o Micrococcus spp. Además, las infecciones por bacteriófagos también son bien conocidas en otras especies industrialmente útiles tales como la Bacillus spp., Enterobacteriaceae spp. incluyendo E. coli, Corynebacteríum spp., Actinomycetes spp. y Brevibacterium spp.

En la industria alimentaria, los cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico son usados ampliamente para las fermentaciones alimenticias. Parece que entre los elementos de las bacterias del ácido láctico Lactococcus spp. son las más devastadas por infecciones por bacteriófagos. Un factor, que da lugar a infecciones por bacteriófagos frecuentes en cultivos iniciadores bacterianos del ácido láctico es el hecho de que las condiciones de fermentación en la industria alimentaria incluyendo la industria láctea son generalmente no estériles. Así, aún no ha sido posible eliminar la contaminación por bacteriófagos bajo estas condiciones industriales.

El desarrollo lítico de los fagos implica la adsorción de los fagos a la superficie de la célula huésped, inyección de ADN del fago en el interior de la célula, síntesis de proteínas del fago, réplica del ADN del fago, ensamblaje de fagos de la progenie y liberación de progenie del huésped. Mecanismos mediados por células de interferencia con cualquiera de estos eventos puede prevenir una infección por fago. La capacidad de los cultivos bacterianos de resistir la infección por bacteriófagos durante el uso industrial depende en gran parte de las características de la cepa huésped afectando uno o más de los mencionados mecanismos.

Así, se ha demostrado que los mecanismos de resistencia o de defensa naturales a los bacteriófagos existen en cepas bacterianas que aseguran un cierto nivel de protección contra el ataque por bacteriófagos. Estos mecanismos de defensa natural incluyen la inhibición de adsorción del fago, prevención de penetración de ADN del fago, restricción del ADN del fago e infección abortiva.

La prevención de contacto productivo entre fagos y células bacterianas debido a los alterados receptores de la superficie celular para fagos reduce inmensamente la capacidad de los fagos de atacar las células. La adsorción de los fagos a la superficie celular no es siempre suficiente para la translocación del ADN del fago. Se ha demostrado que las proteínas de la membrana celular de huésped específico están implicadas en la prevención de penetración de ADN del fago.

La restricción/modificación es un mecanismo que funciona por la cooperación de dos sistemas enzimáticos, una enzima de restricción de clivaje del ADN y una enzima modificadora del ADN, normalmente una metilasa. El mecanismo funciona por el clivaje del ADN del fago, según entra en la célula.

La infección del fago abortivo se describe como un mecanismo que interfiere con el desarrollo del fago después de que la expresión en el fago haya iniciado. Esto puede eventualmente llevar a un reducido nivel o terminación de la producción de la progenie viable del fago.

No obstante, como muchos otros rasgos de las cepas bacterianas que son importantes para el rendimiento industrial, los mecanismos naturales de defensa del fago anteriormente descritos han demostrado ser características inestables, ya que pueden ser mediadas por plásmidos. Además, estos mecanismos de defensa son frecuentemente específicos del fago, es decir sólo son activos contra una gama limitada de tipos de bacteriófagos. Por consiguiente, la técnica anterior no es consciente de un mecanismo de resistencia asociado a la célula huésped general y establemente mantenido contra la infección por bacteriófagos.

En base de los mecanismos de los mencionados mecanismos de defensa natural, la industria ha diseñado e implementado estrategias para posiblemente reducir la infección por bacteriófagos de cultivos bacterianos incluyendo cultivos iniciadores para la fermentación de productos lácteos. Las estrategias usadas actualmente incluyen el uso de cultivos iniciadores mezclados y el uso alterno de cepas que tienen diferentes perfiles de susceptibilidad al fago (rotación de cepas).

Tradicionalmente, los cultivos iniciadores en la industria láctea son mezclas de cepas bacterianas del ácido láctico. La composición compleja de los cultivos iniciadores mezclados asegura que esté presente un cierto nivel de resistencia al ataque en el fago. No obstante, un repetido subcultivo de cultivos de cepas mezcladas da lugar a cambios imprevisibles en la distribución de cepas individuales y finalmente la indeseada dominación de la cepa. Esto a su vez puede llevar a una aumentada susceptibilidad al ataque en el fago y riesgo de fallos de la fermentación.

La rotación de cepas bacterianas seleccionadas que son sensibles a los diferentes fagos es otro enfoque para limitar el desarrollo del fago. No obstante, es difícil e incómodo identificar y seleccionar un número suficiente de cepas que tienen perfiles de fago de diferentes tipos para proporcionar un programa de rotación eficiente y confiable. Además, el uso continuado de cepas requiere la monitorización cuidadosa por nuevos fagos infecciosos y la necesidad de sustituir rápidamente una cepa que se infecta por el bacteriófago nuevo por una cepa resistente al fago. En plantas de fabricación donde se hacen grandes cantidades de cultivos iniciadores en masa anticipadamente, una respuesta tan rápida normalmente no es posible.

Estudios han demostrado que una capacidad de crecimiento reducida de un cultivo bacteriano tal como una bacteria de ácido láctico deficiente de proteinasa resulta en una proliferación de fago reducida (Richardson et al., 1983, 1984). No obstante, tales cepas bacterianas están creciendo todavía y son así aún susceptibles al ataque por fagos.

Así, la industria no tiene en su posesión ninguna estrategia confiable para garantizar que los cultivos bacterianos usados para fabricación industrial de productos alimenticios u otros productos son resistentes contra ataques por bacteriófagos. Además, ninguna de las estrategias actualmente usadas previenen infecciones por cualquier tipo de bacteriófagos y ninguna de estas estrategias son capaces de impedir que los bacteriófagos, por un evento mutacional, eludan los mecanismos de resistencia de las cepas de cultivo bacteriano.

Es por lo tanto un objetivo importante de la presente invención proporcionar un método de prevenir la infección por bacteriófagos de cultivos bacterianos que se usan en la fabricación de productos alimenticios y otros productos, en donde los cultivos son completamente resistentes al ataque por todo tipo de bacteriófagos.

El artículo (Meagher et al, Cell, 1997, Vol. 10, páginas 521-536) describe la expresión de proteínas en minicelulas de E. coli por plásmidos recombinantes.

El artículo (Helling et al, J. Bacteriol., 1970, vol. 104, nº. 2, páginas 1027-1029) se refiere a los auxótrofos resistentes al ácido nalidíxico de E. coli.

El artículo (Worland et al, Australian Journal of Plant Physiology, 1999, 26(6), páginas 511-519) describe que los auxótrofos de purina de Rhizobium, perturbados en nodulación, tienen múltiples cambios en la síntesis de proteínas.

El artículo (Antón et al, J. Bacteriol 77(1): 117-8, 1959) describe una timina "requiriendo" un variante de LAB (bacteria del ácido láctico). No se dice en lugar alguno en este artículo que esta variante...

1. Método para modificar un material de sustrato mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente activo en dicho sustrato, por lo cual el cultivo bacteriano no es susceptible al ataque por bacteriófagos, el método comprendiendo

(i) aislar una cepa bacteriana que no es capaz de replicación de ADN en dicho material de sustrato pero es capaz de modificar metabólicamente el material de sustrato, en donde la cepa bacteriana es una cepa mutante que es auxotrófica con respecto a un compuesto que no está presente en el material de sustrato y que es requerido por la cepa para la replicación de ADN,

(ii) propagar la cepa seleccionada en un medio en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un cultivo de dicha cepa,

(iii) añadir el cultivo bacteriano obtenido al material de sustrato y mantener el material bajo condiciones donde el cultivo es metabólicamente activo,

por lo cual, si el material de sustrato está contaminado con un bacteriófago, la actividad metabólica del cultivo bacteriano está sustancialmente sin afectar por el bacteriófago, y en donde el cultivo bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp. Strepococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. Micrococcus spp., Bacillus, spp., Actinomycetes spp., Corynebacteríum spp. y Brevibacterium spp; y en donde el material de sustrato es un material iniciador para un producto comestible, el material es seleccionado del grupo que consiste en leche, un material vegetal, un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino, una masa y un rebozado; y en donde el cultivo bacteriano conforme es obtenido en el método se usa como un cultivo iniciador en la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto alimenticio y un producto de pienso.

2. Método según la reivindicación 1, en donde la cepa mutante es un mutante Por que incluye la cepa de Lactococcus lactis DN105 depositada bajo el número de registro DSM 12289.

3. Método según la reivindicación 1, en donde la cepa mutante es un mutante thyA que incluye la cepa de Lactococcus lactis MBP71 depositada bajo el número de registro DSM12891.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cultivo bacteriano es de Lactococcus lactis.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cepa bacteriana es añadida al material de sustrato a una concentración en la gama de 10⁵ a 10⁹ CFU/mL o g del material.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cultivo comprende una cepa genéticamente modificada que, con respecto a su cepa progenitora es incrementada en al menos una vía metabólica.

7. Método según la reivindicación 6, en donde la cepa modificada genéticamente tiene, con respecto a su cepa progenitora, una actividad metabólica incrementada seleccionada del grupo que consiste en flujo glicolítico incrementado y flujo incrementado a través de la vía de pentosa fosfato.

8. Método según la reivindicación 7, en donde la cepa modificada genéticamente tiene, con respecto a su cepa progenitora, una actividad de ATPasa incrementada.

9. Método según la reivindicación 1, en donde el cultivo bacteriano comprende una cepa que es un mutante condicional, que a una condición predeterminada no realiza la replicación de ADN.

10. Método según la reivindicación 9, en donde la predeterminada condición es seleccionada del grupo que consiste en pH, temperatura, composición del material de sustrato y presencia/ausencia de una sustancia inductora.

11. Método según la reivindicación 1, en donde el cultivo comprende una cepa bacteriana que es capaz de aumentar el tamaño de las células sin mitosis.

12. Uso de un cultivo conforme se obtiene en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como un cultivo iniciador en la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto alimenticio y un producto de pienso.

13. Bacteria de ácido láctico mutante, en donde la cepa mutante es la cepa de Lactococcus lactis MBP71 del mutante thyA depositada bajo el número de registro DSM12891.