METODO DE IDENTIFICACION DE EPITOPOS RELACIONADOS CON LA INMUNOGENICIDAD EN BIOFARMACOS.

Método para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido terapéutico,

que comprende:

a) identificar los péptidos inmunogénicos del polipéptido terapéutico, comprendiendo:

i) proporcionar células que expresan moléculas del MHCII en una cantidad total de entre 0,1 y 5 µg de moléculas,

ii) poner en contacto las células de (i) con una fuente de péptidos inmunogénicos,

iii) aislar de las células los complejos de molécula del MHCII-péptido inmunogénico,

iv) eluir los péptidos asociados de las moléculas del MHCII,

v) identificar los péptidos inmunogénicos,

vi) verificar que los péptidos inmunogénicos identificados son epítopos,

b) modificar los epítopos correspondientes del polipéptido de manera que la unión de las moléculas del MHCII se reduzca o se elimine,

c) creando de esta manera un polipéptido modificado con potencial de inmunogenicidad reducido o nulo

Método de identificación de epítopos relacionados con la inmunogenicidad en biofármacos.

Un aspecto que contribuye a la inmunotoxicidad de los terapéuticos biológicos es su inmunogenicidad. Los biofarmacéuticos que son inmunogénicos dan lugar a anticuerpos que pueden conducir a pérdida de potencia y a sucesos adversos tales como alergia, reacciones de infusión o autoinmunidad, en ensayos clínicos. El potencial de ser inmunogénico se basa en la presencia de epítopos de células T dentro de la secuencia de un farmacéutico proteína. La presente invención se refiere a un método in vitro para identificar epítopos que podrían desempeñar un papel causal en la inducción de inmunogenicidad de los biofarmacéuticos, tales como anticuerpos u otras proteínas terapéuticas. Más específicamente, el método de la invención puede utilizarse para determinar la secuencia de los péptidos inmunogénicos presentados mediante receptores peptídicos de células dendríticas, que desencadenan reacciones inmunológicas que conducen a la inmunogenicidad. El conocimiento de los epítopos inmunogénicos abre la posibilidad de eliminar el riesgo implícito en los polipéptidos terapéuticos, mediante mutagénesis sitio-dirigida con el fin de generar biofarmacéuticos no inmunogénicos.

Los métodos utilizados hasta hoy para determinar los epítopos que podrían convertir a proteínas farmacéuticas en inmunogénicas se basan en algoritmos de predicción in silico, el cribado in vitro de péptidos sintéticos solapantes en ensayos de activación de las células T o en modelos animales de vacunación. El método de la presente invención se basa en aislar péptidos inmunogénicos a partir de células dendríticas humanas que han sido pulsadas con la proteína farmacéutica respectiva, y la determinación de la secuencia de los epítopos potenciales de células T de la proteína farmacéutica.

Se conocen métodos para identificar péptidos antigénicos. El documento EP nº A-1405862 da a conocer métodos útiles para identificar péptidos antigénicos asociados a enfermedad procedentes de células o líquidos corporales derivados de un organismo mamífero en una cantidad suficiente para determinar la secuencia e identidad de los mismos. Los péptidos antigénicos pueden utilizarse con fines diagnósticos o terapéuticos y para el control de la calidad de las vacunas.

El documento WO nº 2005/014622 A da a conocer métodos para asilar e identificar péptidos derivados de suero o de líquido sinovial de pacientes que presentan artritis reumatoide (AR). Los péptidos antigénicos de la AR asociados al MHC de clase II pueden utilizarse como marcadores para el diagnóstico de la AR y en la terapia como vacunas anti-AR.

Prácticamente cualquier proteína terapéutica manifiesta cierto grado de inmunogenicidad en ensayos clínicos. El desencadenante inicial para la inmunogenicidad es la activación de los linfocitos T CD4+ tras el reconocimiento de fragmentos peptídicos de la proteína farmacéutica respectiva. Estos péptidos se denominan "epítopos de células T" o, abreviadamente, "epítopos".

La activación de las células T CD4+ únicamente se consigue en el caso de que los epítopos de las células T se presenten en el contexto de moléculas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). En el ser humano, las moléculas del MHC se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA). Los péptidos asociados a HLA son cortos, de longitud comprendida entre 9 y 25 aminoácidos (Kropshofer, H. & Vogt, A.B., Immunol. Today 18:77-82, 1997).

Con respecto a su función, pueden distinguirse dos clases de complejos MHC-péptido (Germain, R., Cell 76:287-299, 1994): (i) prácticamente todas las células nucleadas pueden expresar complejos MHC de clase I-péptido con el fin de atraer células T citotóxicas CD8+ que lisan las células infectadas o las células tumorales, (ii) los complejos MHC de clase II-péptido son expresados constitutivamente únicamente en las denominadas células presentadoras de antígeno (APCs), tales como los linfocitos B, los macrófagos o las células dendríticas (DCs). En particular las DCs presentan la capacidad de cebar las células T ayudantes CD4+ y de esta manera iniciar la inmunogenicidad (Banchereau J. & Steinman, R.M., Nature 392:245-254, 1998).

La presente invención proporciona un método para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido terapéutico, que comprende:

a) identificar los péptidos inmunogénicos del polipéptido terapéutico, que comprende:

1. Método para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido terapéutico, que comprende:

        a)        identificar los péptidos inmunogénicos del polipéptido terapéutico, comprendiendo:

i)        proporcionar células que expresan moléculas del MHCII en una cantidad total de entre 0,1 y 5 µg de moléculas,

ii)        poner en contacto las células de (i) con una fuente de péptidos inmunogénicos,

iii)        aislar de las células los complejos de molécula del MHCII-péptido inmunogénico,

iv)        eluir los péptidos asociados de las moléculas del MHCII,

v)        identificar los péptidos inmunogénicos,

vi)        verificar que los péptidos inmunogénicos identificados son epítopos,

        b)        modificar los epítopos correspondientes del polipéptido de manera que la unión de las moléculas del MHCII se reduzca o se elimine,

        c)        creando de esta manera un polipéptido modificado con potencial de inmunogenicidad reducido o nulo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las células que expresan MHCII son células dendríticas.

3. Método según la reivindicación 2, en el que las células dendríticas se exponen a una fuente potencial de inmunógeno en forma de células dendríticas inmaduras, induciéndolas simultáneamente a que maduren para formar células dendríticas.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fuente de inmunógeno potencial pertenece al grupo que comprende polipéptidos, incluyendo polipéptidos terapéuticos, tales como citoquinas, quimoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos, enzimas, proteínas estructurales, hormonas o un fragmento de los mismos.

5. Método según las reivindicaciones 1 a 4, en el que los complejos de moléculas del MHCII con péptidos inmunogénicos se aíslan a partir de las células utilizando métodos que comprenden la solubilización de las células con un detergente y el secuestro de los complejos de moléculas del MHCII con péptidos inmunogénicos mediante inmunoprecipitación o cromatografía de inmunoafinidad.

6. Método según las reivindicaciones 1 a 5, en el que los complejos secuestrados de moléculas del MHCII con péptidos inmunogénicos se lavan con agua en un tubo de ultrafiltración antes de eluir los péptidos.

7. Método según las reivindicaciones 1 a 6, en el que los péptidos inmunogénicos se eluyen de las moléculas del MHCII utilizando ácido diluido.

8. Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que los péptidos inmunogénicos aislados de (a)(iv) se fraccionan y se secuencian.

9. Método según la reivindicación 8, en el que los péptidos inmunogénicos aislados se fraccionan y se secuencian mediante métodos que comprenden cromatografía líquida y espectrometría de masas.

10 Método según las reivindicaciones 1 a 9, en el que los péptidos inmunogénicos aislados se identifican mediante la comparación del péptido identificado procedente de las células que han estado en contacto con una fuente de inmunógeno potencial con aquéllas que han sido identificadas procedentes de células que no han estado en contacto con dicha fuente.

11. Método según las reivindicaciones 1 a 10, en el que los péptidos inmunogénicos son péptidos inmunogénicos procesados naturalmente.