Un método para detectar un reactivo específico de la diana que comprende las etapas de:

a) seleccionar una célula que tiene una molécula diana seleccionada localizada en una porción seleccionada de las que están sobre la pared celular o en la célula,

b) cultivar la célula en una placa (4) de filtro multipocillo hidrófilo con un medio de cultivo;

c) poner en contacto las células cultivadas en un pocillo (10) de dicha placa de filtro multipocillo con un reactivo que comprende un ligando para una molécula diana seleccionada en o sobre la célula, siendo seleccionado el ligando de ligandos que contienen un marcador detectable y ligandos que son capaces de unirse a un ligando secundario que contiene un marcador detectable,

d) lavar las células cultivadas en dicho pocillo por flujo por gravedad por lo menos una vez con un líquido de lavado para retirar cualquier reactivo que no esté unido a la molécula diana seleccionada de la célula para proporcionar una célula lavada; y

e) buscar el ligando para indicar la presencia o ausencia de la molécula diana,

caracterizado porque el tamaño medio de poro de la placa de filtro está entre 1 y 3,5 micrómetros y es suficiente para permitir que el medio de cultivo, líquido de lavado y ligandos sin unir pasen a través de ella bajo los efectos de la gravedad reteniendo las células cultivadas, y porque en la etapa d) se permite que algo de líquido de lavado permanezca en dicho pocillo para prevenir que dicho pocillo se seque

Ensayos de alto rendimiento basados en células, métodos de uso y kits.

La invención se refiere a ensayos de alto rendimiento basados en células, a métodos para usar tales ensayos y a kits para tales ensayos. Más particularmente, se refiere a una etapa de lavado/filtración basada en la gravedad para ensayos celulares de alto rendimiento tales como inmunoensayos.

Antecedentes de la invención

El uso de varios métodos para detectar las interacciones entre una célula y otra entidad (generalmente un fármaco o un candidato a fármaco, una toxina, contaminante medioambiental, etc.) es bien conocido en la técnica. Están generalmente disponibles varios de estos formatos de ensayo basado en células. Estos ensayos se usan para detectar el efecto de un compuesto de ensayo en la expresión de una o más moléculas marcadoras (generalmente proteínas) de una célula.

Los ensayos basados en células generalmente miden una respuesta distinguible que requiere un inmunoensayo para una molécula marcadora específica de diferenciación tal como una proteína sobre la pared celular o intracelular de la molécula. Generalmente, por lo menos se añade un primer ligando (primer anticuerpo u otra entidad) que se une a la molécula marcadora de la célula y por sí mismo o con un ligando secundario (tal como un anticuerpo secundario que tiene un marcador detectable) es capaz de ser detectado, generalmente, por fluorometría, colorometría o radiactividad.

Los inmunoensayos se complican por la necesidad de retirar los ligandos sin unir antes de la etapa de detección. Típicamente esto se ha conseguido con protocolos de lavado con centrifugación. El nivel de líquido después de la adición de uno o más ligandos es reducido y se añade un tampón de lavado a la disolución. Esta se centrifuga a continuación y se retira el sobrenadante dejando las células en un pequeño volumen de líquido. Las etapas de lavado se repiten a menudo 3-8 veces para asegurar la retirada sustancial de los materiales sin unir.

Este es un procedimiento que lleva tiempo y está limitado en el número de tubos que pueden ser procesados en un tiempo dado por una persona. No es tampoco fácilmente compatible con la automatización si lo es de algún modo. Adicionalmente, la cantidad retirada y de dónde es retirada varía y conduce a la pérdida de células por decantación y debido al estrés o muerte debida a la falta de líquido (si se ha retirado demasiado). Similarmente, el número de lavados se debe mantener alto para asegurar que se retira suficiente reactivo de fondo de modo que se pueda hacer una medida precisa.

El documento US 2001/0055776 A1 sugirió el uso de vacío con una placa de filtro multipocillo para proporcionar un formato de más alto rendimiento. El bajo vacío es difícil de controlar y cada pocillo varía en su respuesta al bajo vacío. Esto conduce a resultados inconsistentes entre pocillos, secándose algunos pocillos mientras que otros retienen demasiado fluido conduciendo a falsas señales positivas. Lo que es más importante, la recuperación de células es sustancialmente baja, aunque en algunos casos puede permitir un ensayo usando el bajo número de células restantes.

Somos conscientes de la publicación de patente internacional WO 9524648 (Fodstad Oeystein et al.) que se refiere a un método y aparato para detectar células diana específicas de una manera única y que ahorra tiempo, usando partículas paramagnéticas, anticuerpos que reconocen las porciones Fc de anticuerpos que se asocian a células diana y anticuerpos que se asocian a células diana dirigidos a determinantes de antígeno específico en las membranas de la célula diana. La incubación de la suspensión de células con detergente y/o segundos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, premarcados o no con agentes fluorescentes, metalocoloides, radioisótopos, complejos de biotina o ciertas enzimas que permiten la visualización, incrementa drásticamente la especificidad del método. El método y aparato descrito proporciona un soporte sólido y un registro permanente que se ve fácilmente por microscopía, permite la vista y cuantificación de toda la muestra en lugar de pequeñas fracciones de ella y permite el uso de grandes volúmenes de muestra para ser analizados, el dispositivo se puede escanear también automáticamente por tecnología densitométrica convencional. El método y aparato se puede usar para el aislamiento de las células diana por aplicación de campos magnéticos, y se describe un kit y aparato para realizar el método según la invención.

La falta de un ensayo de alta viabilidad/retención de células y alto rendimiento es un cuello de botella significativo en la consecución de todo el potencial de la proteonómica para el descubrimiento de fármacos. La presente invención proporciona tal solución.

Sumario de la invención

En la presente invención se colocan células en una placa multipocillo y se cultivan. Cuando se va a realizar el ensayo, se usa la gravedad para separar por lavado los ligandos sin unir en lugar del vacío o centrifugación. Las células se examinan a continuación para detectar el ligando unido.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un ensayo de placa de filtro multipocillo por flujo por gravedad.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un ensayo de placa de filtro multipocillo que tiene un filtro de policarbonato por flujo por gravedad.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un ensayo de placa de filtro multipocillo que tiene un filtro de policarbonato hidrófilo por flujo por gravedad.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en una placa de filtro multipocillo que tiene un filtro de policarbonato hidrófilo con un tamaño de poro de alrededor de 3 micrómetros por flujo por gravedad.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para el lavado de células usado en un ensayo de placa de filtro multipocillo por flujo por gravedad para obtener una alta retención de células.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un método para detectar un reactivo específico de una diana que comprende las etapas de:

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un anticuerpo primario y uno secundario como ligando en el método.

Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar un anticuerpo primario y uno secundario como ligando en el método y detectar la unión del anticuerpo primario a la molécula diana por medio del uso de fluorescencia, quimioluminiscencia, colorometría o detección radiactiva del anticuerpo secundario que está unido al anticuerpo primario.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un dispositivo para la filtración por gravedad de fluidos de lavado y reactivos sin unir formado de una placa de filtro que tiene dos o más pocillos, estando cubierto el fondo de cada pocillo con una membrana porosa; una placa portadora que tiene pocillos iguales en número y en registro con los pocillos de la placa de filtro, teniendo los pocillos del portador las partes superiores e inferiores abiertas; y una bandeja de recogida.

Es un objetivo adicional de la presente...

1. Un método para detectar un reactivo específico de la diana que comprende las etapas de:

caracterizado porque el tamaño medio de poro de la placa de filtro está entre 1 y 3,5 micrómetros y es suficiente para permitir que el medio de cultivo, líquido de lavado y ligandos sin unir pasen a través de ella bajo los efectos de la gravedad reteniendo las células cultivadas, y porque en la etapa d) se permite que algo de líquido de lavado permanezca en dicho pocillo para prevenir que dicho pocillo se seque.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la placa de filtro tiene baja fluorescencia de fondo, y comprende adicionalmente, entre las etapas d) y e):

en el que, en la etapa d2) se permite que algo de líquido de lavado permanezca en dicho pocillo para prevenir que dicho pocillo se seque.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la placa tiene:

4. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que el ligando tiene una entidad detectable seleccionada de materiales fluorescentes, materiales radiactivos, quimioluminiscencia, medidas de absorbancia de luz y densidad óptica.

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la molécula diana es una proteína marcadora, tal como

6. El método de la reivindicación 1 o 2, adaptado para detectar un inmunoensayo, en el que la molécula diana es una proteína diana, el filtro está formado de policarbonato hidrófilo poroso que tiene un tamaño de poro nominal de alrededor de 3 micrómetros; el reactivo es por lo menos un anticuerpo para la proteína diana seleccionada y se usa un dispositivo de detección para buscar el anticuerpo para indicar la presencia o ausencia de la proteína diana.

7. Un kit para realizar inmunoensayos, que comprende una placa (2) multipocillo que tiene una membrana (12) hidrófila con un tamaño medio de poro entre 1 y 3,5 micrómetros, un portador (4) multipocillo hidrófilo que tiene una parte superior abierta y un fondo abierto estando los pocillos alineados y capaces de estar en registro con los pocillos de la placa de filtro, y una bandeja (6) de recogida de filtrado capaz de soportar la superficie inferior del portador sobre sus superficies superiores y la placa de filtro soportada sobre las superficies superiores del portador.

8. El kit de la reivindicación 7,