Un procedimiento para determinar un grupo sanguíneo de una muestra de sangre,

que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de sangre, que comprende glóbulos rojos a un dispositivo que comprende un sustrato que comprende uno o más agentes de unión unidos a él, en el que dichos agentes de unión son capaces de unirse de manera específica a antígenos del grupo de los glóbulos rojos específicos que pueden estar presentes en la muestra de sangre; b) permitir que cualesquiera antígenos de glóbulos rojos presentes en la muestra de sangre reaccionar de manera específica con dichos agentes de unión unidos; c) sustancialmente eliminar o reducir cualquier material no unido de al menos un área del sustrato al que dichos agentes de unión están unidos; y d) detectar directamente cualesquiera antígenos unidos a dichos agentes de unión con el fin de determinar un grupo sanguíneo de sujetos; llevándose a cabo la detección mediante exposición de los glóbulos rojos unidos a una primera longitud de onda y detectar la fluorescencia intrínseca de los glóbulos rojos unidos a una segunda longitud de onda más larga

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de antígenos de grupos sanguíneos presentes en una muestra de glóbulos rojos que se están ensayando dichos procedimientos no emplean la adición de marcas extrínsecas para detectar dichos antígenos de superficie celular. La detección se lleva a cabo usando una capacidad de fluorescencia intrínseca de los glóbulos rojos que se están ensayando.

Antecedentes de la Invención

La tipificación de la sangre en los campos clínicos y de transfusión se lleva a cabo de manera típica usando ensayos de tipificación o bien en placas de pocillos múltiples, véase por ejemplo, documento US 4.770.856, o en formato tarjeta/columna (por ejemplo los documentos US 5.552.064 y US 5.338.689). Adicionalmente, la tipificación por procedimiento múltiple se puede llevar a cabo usando citometría de flujo, pero esto requiere marcado fluorescente y aparato relativamente complejo.

El documento US 4.851.210 desvela un dispositivo de tipificación de sangre basado en el flujo capilar a través de una membrana, que comprende una disposición para los anticuerpos de tipo específico capaz de unirse manera inmunoespecífica a los glóbulos rojos. Los glóbulos rojos unidos se pueden detectar visualmente por el color rojo de las células, o mediante el uso de agentes detectables tales como colorantes, anticuerpos marcados de manera detectable, o

o ligandos de actividad marcados de manera detectable.

El documento EP0223978 desvela procedimientos y dispositivos para determinar la clasificación del grupo sanguíneo de las muestras de sangre o suero, utilizando un sustrato poroso que comprende uno o más anticuerpos unidos a él en áreas de adsorción delimitadas. Los glóbulos rojos unidos se detectan mediante una señal de color de eritrocitos unidos a los anticuerpos.

No obstante, cualesquiera sistemas actuales que dependen de la detección visual en general requieren una muestra relativamente grande se sangre y / o un área suficientemente grande de para unirse a los glóbulos rojos, de modo que el color se pueda discernir fácilmente visualmente se apreciará que pueden ser no deseables. Además, la detección visual puede ser no preferible ya que puede dar como resultado un error humano e interpretación incorrecta de resultados. De este modo, puede ser deseable utilizar un sistema automático.

Es un objeto de la presente invención obviar y / o mitigar al menos una de las desventajas anteriormente mencionadas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en parte en las observaciones por los presentes inventores que ciertas células son capaces de auto-fluorescencia. Esto es, las células se pueden exponer a la luz de una primera longitud de onda y puede ser fluorescente a una segunda longitud de onda, que se pueda detectar, usando, por ejemplo, un aparato foto elector apropiado. De esta manera las células se pueden detector sin el uso de agentes de marcado adicionales.

En un primer aspecto se proporciona un procedimiento para determinar un grupo sanguíneo de una muestra de sangre, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre, que comprende glóbulos rojos a un dispositivo que comprende un sustrato que comprende uno o más agentes de unión unidos a él, en el que dichos agentes de unión son capaces de unirse de manera específica a antígenos del grupo de los glóbulos rojos específicos que pueden estar presentes en la muestra de sangre;

b) permitir que cualesquiera antígenos de glóbulos rojos presentes en la muestra de sangre reaccionar de manera específica con dichos agentes de unión unidos;

c) sustancialmente eliminar o reducir cualquier material no unido de al menos un área del sustrato al que dichos agentes de unión están unidos; y

d) detectar directamente cualesquiera antígenos unidos a dichos agentes de unión con el fin de determinar un grupo sanguíneo de sujetos; llevándose a cabo la detección mediante exposición de los glóbulos rojos unidos a una primera longitud de onda y detectar la fluorescencia intrínseca de los glóbulos rojos unidos a una segunda longitud de onda más larga.

Los ensayos de la presente divulgación se pueden usar para detectar, por ejemplo, cualquier antígeno de grupo sanguíneo específico. Los sistemas de grupos sanguíneos más comunes son los sistemas ABO y D (Rhesus) bien conocidos en la técnica, aunque otros sistemas tales como Kell, Duffy, Lewis, Kidd y Fisher también se conocen y se pueden ensayar para o de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Véase también Handbook of Transfusion Medicine, McClelland, DBL, Ed; TSO Londres, 2001.

Típicamente, los agentes de unión son anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos de los antígenos a detectar. Sin embargo, se pueden emplear otros agentes de unión específicamente reactivos, tales como miméticos de anticuerpo de molécula pequeña, o receptores de otras células que son capaces de unirse a dichos antígenos. También se pueden emplear lectinas. Sin embargo, para simplicidad de aquí en adelante se hará referencia a anticuerpos, pero no se debe considerar como limitante.

Con el fin de detectar si un determinante antigénico particular está presente o no en una muestra de células, se proporcionará un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente al antígeno particular, unido al sustrato. Por ejemplo, para detectar células del tipo ABO, el sustrato comprenderá anticuerpos anti-A y anti-B. Células que se unen solamente a los anticuerpos anti-A sera el tipo A; células que se unen solamente a los anticuerpos anti-B serán del tipo B; células que se unen a los anticuerpos anti-A y anti-B serán el tipo AB; y células que no se unen a cualesquiera anticuerpos anti-A o anti-B serán el tipo O. Con referencia a la detección de si o no una muestra de células sanguíneas son Rhesus-positivo o Rhesus negativo, anticuerpos Anti-D, Anti-C y / o Anti-E en general se unirán al sustrato ya que el D antígeno es el más potente de los antígenos de Rhesus y el más comúnmente implicado en la sensibilización por transfusión o embarazo.

Como un control positivo, con el fin de asegurar que los antígenos de glóbulos rojos están de hecho unidos, se pueden usar lectinas o anti-H. Esto puede ser ventajoso cuando ni los anticuerpos anti-A o anti-B se unen a los glóbulos rojos, como puede ser el caso cuando la sangre es del tipo O.

Los anticuerpos unidos al sustrato pueden ser policlonal o monoclonal. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas del suero de animales inmunizadas con un antígeno, o si derivado funcional antigénico. Para la producción de anticuerpos policlonales, se pueden inmunizar animales por ejemplo conejos, ovejas, cerdos, etc., se pueden inmunizar mediante inyección con un antígeno específico suplementado opcionalmente con adyuvantes.

Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para una antígeno particular, se puede obtener mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Éstos incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature 256: 495 - 497; y la Patente de Estados Unidos US Nº 4.376.110), la técnica de hibridoma de células B (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026 - 2030), y la técnica de hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Anti-bodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p.77 - 96).

Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquiera de sus subclases. El hibridoma que produce el mAb se puede cultivar in vitro o in vivo. La producción de altas valoraciones de mAbs in vivo hace que éste sea el procedimiento de producción actualmente preferido.

Además, se pueden usar técnicas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851 - 6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604 - 608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452 - 454; Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567) por unión de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad de antígeno apropiada conjuntamente con los genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar un grupo sanguíneo de una muestra de sangre, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de sangre, que comprende glóbulos rojos a un dispositivo que comprende un sustrato que comprende uno o más agentes de unión unidos a él, en el que dichos agentes de unión son capaces de unirse de manera específica a antígenos del grupo de los glóbulos rojos específicos que pueden estar presentes en la muestra de sangre;

b) permitir que cualesquiera antígenos de glóbulos rojos presentes en la muestra de sangre reaccionar de manera específica con dichos agentes de unión unidos;

c) sustancialmente eliminar o reducir cualquier material no unido de al menos un área del sustrato al que dichos agentes de unión están unidos; y

d) detectar directamente cualesquiera antígenos unidos a dichos agentes de unión con el fin de determinar un grupo sanguíneo de sujetos; llevándose a cabo la detección mediante exposición de los glóbulos rojos unidos a una primera longitud de onda y detectar la fluorescencia intrínseca de los glóbulos rojos unidos a una segunda longitud de onda más larga.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el antígeno del grupo sanguíneo a determinar es de los sistemas ABO y / o D (Rhesus).

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que el antígeno de sangre a determinar es del antígeno del grupo sanguíneo Kell, Dutty, Lewis, Kidd y cualquier otro detectable usando sistemas de reactivos específicos apropiados.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el agente de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para dicho (s) antígeno (s) a detectar.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende además el uso de un control positivo para asegurar que los antígenos de los glóbulos rojos son capaces de unirse a dicho agente de unión.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dichos agentes de unión están unidos al sustrato en la forma de una disposición.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que cada agente de unión específica se proporciona en un número de diluciones y / o número de veces repetido, con el fin de minimizar cualesquiera reacciones falsas positivas o negativas que se puedan producir, cuando se lleva a cabo el procedimiento de detección.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el sustrato está hecho de vidrio, silicio, óxido de silicio, metales y óxidos de metal, bien sencillos o funcionarizados con polímeros funcionales tales como glicidoxipropiltrietoxisilano, poli-1-lisina, aminopropilsilano, carboxisilano, hidrogeles y cepillos de polímero, monocapas auto ensambladas de por ejemplo alquil tioles funcionalizados.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el sustrato es un sustrato recubierto de oro.

10. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 9 en el que el oro está funcionalizado de manera que los agentes de unión son capaces de estar unidos a él.

11. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 10 en el que la funcionalización es tal que una distancia entre la superficie de oro y cualesquiera glóbulos rojos se pueden controlar.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 - 11 en el que la disposición se forma sobre un sustrato plano o esferoide.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el sustrato es un soporte rígido o semi-rígido que incluye membranas, filtro, escamas, portaobjetos, obleas, fibras, perlas magnéticas o no magnéticas, geles, tubos, placas, polímeros, micropartiículas y capilares.

14. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 13 en el que el sustrato incluye una arquitectura de superficie modificada.

15. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dichos agentes de unión se manchan, imprimen o unidos de otra manera al sustrato.

16. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el sustrato comprende una pluralidad de disposiciones separadas sobre la superficie del sustrato, dispuesta de una manera que permita separar las muestras a poner en contacto con cada disposición, de tal forma que las muestras no se mezclen y con el fin de que más de una muestra se pueda ensayar.

5 17. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el material no unido se retira mediante lavado de la superficie del sustrato con una solución tal como agua salina, mediante soplado o succión de aire a través de la superficie del sustrato, o mediante el uso de centrifugación, o agitando para dispersar el material no unido de la superficie del sustrato.

18. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que los glóbulos rojos se irradian o excitan con luz con una longitud de onda de aproximadamente 420 nm, 488 nm, 543 nm o 580 nm y emisión detectada a una longitud de onda más larga.

19. El procedimiento de acuerdo con reivindicación 18 en el que los glóbulos rojos se irradian o excitan a 488 nm y detección se lleva a cabo a 530 nm, o se irradian o excitan a 543 nm y detección llevada a cabo a 570 - 585 nm.

20. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 en el que cualquier fluorescencia se 15 detecta por un foto-detector.

21. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que el software estadístico se utiliza de manera que se combine y formule a partir de los resultados de diversas repeticiones y / o diluciones antes de mostrar/proporcionar un resultado al ensayador