Un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra,

que comprende: - proporcionar una mezcla de reacción que contenga di5 chos ácidos nucleicos, - detectar señales a partir de dicha mezcla de reacción en intervalos conocidos, - transformar dichas señales en datos de medida, y - crear a partir de dichos datos de medida una curva de crecimiento mediante un algoritmo matemático, que se caracteriza porque dicho algoritmo matemático comprende la fórmula matemática del modelo de curva de crecimiento **(Ver fórmula)**o sus equivalentes matemáticos, en la que los parámetros son los siguientes: 15 x es una medida del tiempo o secuencia de las medidas p1 es la intersección de la curva de crecimiento al inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de saturación, p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial, p5 es el punto de inflexión de una primera función 25 sigmoidal multiplicativa, p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una segunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa en la que los valores óptimos de los parámetros se determinan mediante un algoritmo de ajuste de regresión no lineal a dichos datos de medida

Campo de la invención

El sujeto de la presente invención es un método para la determinación de la presencia de un analito y un instrumento analítico capaz de realizar dicho método.

Antecedentes de la invención

La invención es útil en el campo del análisis o el

diagnóstico, particularmente en el diagnóstico de ácidos nucleicos. El análisis de ácidos nucleicos se ha mejorado considerablemente mediante la invención de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describe en las PE 0 200 362 y PE 0 201 184. Durante la realización de este método, la cantidad de ácidos nucleicos se aumenta exponencialmente, al menos parcialmente, ya que en teoría, a partir de cada secuencia de ácidos nucleicos presente en la mezcla de reacción en cada ciclo de reacción se crea un ácido nucleico adicional, y cada una de tales secuencias puede actuar como un molde para la creación de una nueva secuencia de ácidos nucleicos en el siguiente ciclo de reacción. La cantidad de ácidos nucleicos creada está limitada por la cantidad de reactivo, como la enzima, los cebado-res y nucleótidos, contenidos en la mezcla de reacción. Por lo tanto, la representación de la concentración frente al tiempo o el número de ciclos de la PCR aparece como una curva (asimétrica) sigmoide.

Una mejora adicional de la PCR es la denominada PCR a tiempo real. En este método, se genera una señal y se detecta durante la amplificación. La señal es representativa de la cantidad de ácidos nucleicos generados durante la amplificación y por lo tanto presentes en la mezcla de reacción. En una primera realización, por ejemplo descrita en la PE 0 512 334, la señal se genera mediante un compuesto capaz de intercalarse en los ácidos nucleicos de doble cadena y a la vez cambiar sus propiedades de fluorescencia. En otra realización, como la descrita en la PE 0 543 942, cada reacción de extensión de un cebador da lugar a la escisión de una sonda, marcada mediante un bloqueador de la fluorescencia y un colorante emisor de forma que cuando se escinde la sonda, el bloqueador no puede bloquear la emisión de luz del colorante de marcaje, de forma que se puede detectar la señal.

La determinación de la cantidad de ácidos nucleicos originalmente presentes en la muestra previamente a la amplificación (cuantificación) ha sido el objetivo de varias investigaciones. Generalmente, cuanto mayor sea la cantidad menor será el número de ciclos de reacción necesarios para que se reciba una intensidad definida de la señal (umbral). Los primeros cálculos se basaban, por lo tanto, en la determinación del ciclo umbral o valor (CT). Cuando más elevado es el valor CT, menor es la cantidad original de ácidos nucleicos presentes.

Obviamente, el número (entero) de ciclos de reacción

realizados es sólo una estimación muy poco precisa de la

cantidad originalmente presente. Así, en un nuevo intento de determinar la concentración, las intensidades de la señal que quedan entre distintos datos de medida se interpolan (lineal o logarítmicamente). Esta método basado en la interpolación posee algunas deficiencias en el caso de medidas de señal imprecisas o incluso valores de medida atípicos. Para evitarlo, se han establecido algoritmos para generar curvas de crecimiento continuas a partir de un número definido de medidas durante la reacción de amplificación. Un ejemplo de un algoritmo es el denominado filtro Sawitzky Golay. Las curvas resultantes se denominan curvas de crecimiento. En la PE 0 686 699 se describe una fórmula recursiva condicional que puede utilizarse para ajustar los datos obtenidos a una curva teórica. Sin embargo, la aplicación es incómoda y el proceso de ajuste no está descrito. Puede conducir a fuertes correlaciones entre parámetros y a resultados imprecisos en ciertos casos.

En la WO 97/46714 se describen métodos para monitorizar la hibridación tras una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En particular, la solicitud describe que la sensibilidad de la cuantificación inicial de un molde con representaciones de la fluorescencia frente al número de ciclos puede aumentarse mediante el análisis de la curvas de fusión del producto para controlar la amplificación no específica y mediante los algoritmos de ajuste de la curva de Levenberg-Marquard, de ajuste por regresión no lineal. La curva de ajuste de este documento posee una línea basal inclinada, una línea de “plateau” inclinada y una parte de

crecimiento intermedio.

En Biotechnology Letters 24, 2002, 2053-2056 se describe un método para determinar la eficiencia de la amplificación mediante RT-PCR utilizando un modelo sigmoidal de cuatro parámetros.

En Biochemical and Biophysical Research Communications 294, 2002, 347-353 también se describe un método de simulación de una PCR para determinar la eficiencia de la PCR.

Estos dos modelos de cuatro parámetros matemáticamente equivalentes proporcionan una exactitud limitada especialmente en las áreas que normalmente son críticas para un cálculo del resultado exacto. La línea basal se fuerza para que sea constante y el término sigmoidal simple no puede aproximar la totalidad de la complejidad de una curva de crecimiento general. Por lo tanto, la fase exponencial se aproxima con una exactitud limitada como se puede observar visualmente en las gráficas de ambos artículos. Esto da lugar a un resultado con una exactitud limitada, por ejemplo de CT.

En Phytopathology vol. 83, nº 9, 1993, 928-932 se describen diez funciones matemáticas utilizadas para describir las curvas de progreso de patrón sigmoidal obtenidas en un análisis de regresión no lineal. Estas funciones son combinaciones aditivas de curvas sigmoidales adecuadas para un crecimiento en dos fases.

Es objeto de la presente invención mejorar el análisis cuantitativo, en particular proporcionar un método completamente automatizado utilizando un cálculo matemático para

mejorar la estimación de la curva de crecimiento completa, especialmente para corregir la imprecisión de la medida y los posibles picos de medida.

Breve descripción de las figuras

En la Fig. 1 se representa una curva de crecimiento que muestra un ejemplo de los parámetros del modelo.

En la Fig. 2 se muestra la curva de crecimiento con la curva de la fase exponencial, la curva sigmoidal de saturación parcial y la línea basal que contribuyen al modelo de la curva de crecimiento.

En la Fig. 3 se representa una representación gráfica del test F del método de la invención frente al modelo lineal.

In Fig. 4 se representa la utilización de p2 y p3/p1 como valores típicos de los parámetros de la señal control interno como medida de la caducidad del reactivo y/o un contenido aumentado de hematíes en la muestra.

Resumen de la invención

En una primera realización, la invención está dirigida a conseguir un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra, como se define en la reivindicación independiente 1.

Otro objeto de la invención es un instrumento analítico para determinar la presencia de un analito en una muestra como se define en la reivindicación independiente 7.

Descripción detallada de la invención

Aunque la invención es útil para la determinación de

cualquier analito, en la mayoría del texto a continuación

la invención se ejemplifica mediante la determinación de ácidos nucleicos. Los métodos para la determinación de la presencia de ácidos nucleicos en una muestra son ampliamente conocidos. Normalmente se basan en la detección de la aparición de hibridación de sondas de ácidos nucleicos, por ejemplo oligonucleótidos, con los ácidos nucleicos a determinar, es decir la formación de híbridos. Sin embargo, también existen métodos que utilizan la detección de la interacción de otros compuestos químicos con los ácidos nucleicos a determinar o con compuestos derivados de estos, por ejemplo la detección de la aparición del intercalado de agentes intercalantes en los ácidos nucleicos de doble cadena. La presente invención proporciona los métodos para determinar el analito siguiendo el curso de una reacción a lo largo de un periodo de tiempo, por ejemplo recogiendo datos recibidos de dicho seguimiento e interpretando los datos recibidos. La presente invención por lo tanto es particularmente útil para el seguimiento de reacciones en las que un cambio detectable...

1. Un método para determinar la presencia de ácidos nucleicos en una muestra, que comprende:

- proporcionar una mezcla de reacción que contenga di5 chos ácidos nucleicos,

- detectar señales a partir de dicha mezcla de reacción en intervalos conocidos,

- transformar dichas señales en datos de medida, y

- crear a partir de dichos datos de medida una curva de crecimiento mediante un algoritmo matemático, que se caracteriza porque dicho algoritmo matemático comprende la fórmula matemática del modelo de curva de crecimiento

**(Ver fórmula)**

o sus equivalentes matemáticos, en la que los parámetros son los siguientes: 15 x es una medida del tiempo o secuencia de las medidas p1 es la intersección de la curva de crecimiento al

inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de saturación,

p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial,

p5 es el punto de inflexión de una primera función 25 sigmoidal multiplicativa, p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una se

gunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y

p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa en la que los valores óptimos de los parámetros se determinan mediante un algoritmo de ajuste de regresión no lineal a dichos datos de medida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho algoritmo comprende la formula

**(Ver fórmula)**

o sus equivalentes matemáticos, en la que: 10 p1 es la intersección de la curva de crecimiento al

inicio de la reacción, p2 es la deriva relativa de la línea basal, p3 es la distancia entre la línea basal y la línea de

saturación,

15 p4 es la pendiente en el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento exponencial,

p5 es el punto de inflexión de una primera función sigmoidal multiplicativa,

20 p6 es la pendiente en el punto de inflexión de una segunda función sigmoidal multiplicativa que representa el crecimiento a saturación, y

p7 es el punto de inyección de una segunda función sigmoidal multiplicativa, 25 p8 es el tamaño de paso de la señal en un punto en el que cambian las condiciones de medida, y

sign significa el signo de la función (x) = x/√(x2), x <> 0; sign (0) = 0 y s es un número de paso de ciclo predeterminado a partir del cual la condición de medida cambia.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que para los cálculos adicionales se reemplazan dichos datos de medida por datos generados utilizando dicho modelo de curva de crecimiento.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende la comparación de uno o más datos característicos de dicha curva de crecimiento con valores de referencia correspondientes.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende la utilización de un algoritmo para determinar un valor a partir de dicha curva de crecimiento indicativa de la concentración de dichos ácidos nucleicos presente en dicha muestra.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que además comprende el paso de determinar a partir de dicha curva de crecimiento si los ácidos nucleicos están presentes o ausentes en dicha mezcla de reacción

7. Un instrumento analítico para la determinación de la presencia de un analito, que comprende:

- una unidad de detección de la señal,

- una unidad de transformación de señal en datos de medida,

- una memoria de datos de medida,

- una unidad de transformación de los datos de medida

en curva de crecimiento,

- una unidad de transformación de la curva de creci

miento en datos digitales, y

- una unidad de comparación de la curva de crecimien5 to,

cuya unidad de transformación de dichos datos de medida en curva de crecimiento comprende un ordenador que contiene un algoritmo totalmente automatizado para el ajuste de regresión no lineal de acuerdo con la reivindicación 1. 8. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7, que además comprende una fuente de luz.

9. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha señal es una señal fluorescente.

10. El instrumento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho ordenador contiene adicionalmente un algoritmo para seleccionar un valor de dicha curva de crecimiento indicativo de la concentración de dichos ácidos nucleicos presentes en dicha muestra.