IDENTIFICACION MOLECULAR DE LAS BACTERIAS DEL GENERO STREPTOCOCCUS Y GENEROS EMPARENTADOS.

Fragmento de un gen rpoB de una bacteria del género Streptococcus y de los 4 géneros emparentados Enterococcus,

Gemella, Abiotrophia y Granulicatella, caracterizado porque su secuencia consiste en una de las secuencias SEC ID nº 8 a 35, y las secuencias complementarias

Identificación molecular de las bacterias del género Streptococcus y géneros emparentados.

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico. Más precisamente, la invención se refiere a un procedimiento para la identificación molecular de las bacterias del género Streptococcus y géneros emparentados, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella mediante unas técnicas de detección y/o de amplificación y de secuenciación con la ayuda de sondas o de cebadores oligonucleotídicos aplicados a unas cepas de estos géneros bacterianos.

Las bacterias del género Streptococcus y de cuatro géneros emparentados: Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella, son unas bacterias cocciformes, gram positivo y catalasa negativa de las cuales se reconocen actualmente más de una cuarentena de especies. Las bacterias del género Lactococcus, clasificadas anteriormente entre los estreptococos tal como Streptococcus grupo N, no están comprendidas en el marco de esta patente debido a su rareza en patología humana, y porque son fácilmente discriminadas de los estreptococos por su crecimiento a +10ºC. El género Streptococcus comprende oficialmente 55 especies. El género Gemella comprende 6 especies, el género Abiotrophia comprende 1 especie, el género Granulicatella comprende 3 especies, el género Enterococcus comprende 24 especies [www.springer-ny-com/bergey-soutline/main.htm]. Estas especies se cultivan fácilmente y con frecuencia a partir de muestras medioambientales, de extracciones clínicas veterinarias y de extracciones clínicas humanas [Ruoff KI. (1999) en Manuel of Clinical Microbiology, p. 283-296, ASM press]. En el ser humano, diferentes especies del género Streptococcus son responsables de infecciones comunitarias eventualmente severas debido al carácter invasivo de los estreptococos considerados o debido a la producción de toxinas y de manifestaciones clínicas eventualmente graves a distancia del foco infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes (estreptococo grupo A) es responsable de anginas y de síndromes pos-estreptocócicos que incluyen el reumatismo articular agudo durante el cual la destrucción de las válvulas cardiacas mediante un proceso inflamatorio es responsable de una valvulopatía eventualmente mortal. Asimismo, varias especies del género Streptococcus, en particular los estreptococos del grupo A, del grupo C, y del grupo G, son responsables de infecciones invasivas mortales en particular de miositis, es decir, de destrucción de los tejidos cutáneos y sub-cutáneos y del tejido muscular tal como se ha descrito desde hace algunos años. Asimismo, por ejemplo, Streptococcus pneumoniae (neumococo) es responsable de neumonía, de meningitis y de septicemia. Por otro lado, las bacterias de los géneros Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia y Granulicatella son responsables de endocarditis, es decir, de infección de las válvulas cardiacas en el ser humano, las cuales constituyen unas enfermedades infecciosas mortales [Casalta JP et al. Journal Clinical Microbiology, 2002, 40:1845-1847]. Asimismo, algunas especies de los géneros considerados son responsables de infecciones nosocomiales, por ejemplo, las bacterias del género Streptococcus del grupo A son responsables de bacteriemias que suceden a unas exploraciones por endoscopia digestiva. Asimismo, las bacterias del género Enterococcus son responsables de infecciones urinarias nosocomiales después de la utilización de antibio-profilaxia por unos antibióticos de la familia de las cefalosporinas a las que son naturalmente resistentes. Estas especies bacterianas plantean por otro lado el problema de su resistencia creciente a los antibióticos, resistencia a la penicilina G de Streptococcus pneumoniae [Garav J. Lancet Infect. Dis. 2002, 2: 404-415] y resistencia a la vancomicina de Enterococcus spp. [Gold H.S. Clin. Infect. Dis. 2001, 33: 210-219; Bonten M.J. et al. Lancet Infect. Dis. 2001, 1: 314-325].

Estas diferentes especies bacterianas plantean el problema de su detección en las muestras patológicas en el ser humano y su identificación cuando han sido aisladas a partir de dichas muestras. Los procedimientos convencionales de detección se basan en efecto en la demostración de bacterias cocciformes gram positivo, con el examen directo del producto patológico. Sin embargo, es conocido que esta detección miscroscópica de las bacterias del género Streptococcus y de géneros emparentados en las muestras clínicas tiene un umbral de sensibilidad de 10⁴ CFU/ml. Por lo tanto, es muy posible que una muestra patológica en el ser humano o en el animal contenga una de las especies consideradas que no sea detectada con el examen microscópico directo de esta muestra patológica. Por otro lado, aunque su estructura sea la de bacterias Gram-positivo, pueden aparecer falsamente Gram-negativo después de la coloración de Gram de la muestra patológica y dar lugar a una identificación errónea o a un punto muerto de identificación. Esto es particularmente frecuente para las bacterias del género Gemella. En el ser humano, es en particular el caso durante el examen anatomopatológico y bacteriológico de las válvulas cardiacas en el caso de una endocarditis.

Cuando una bacteria de una especie de los géneros considerados se aísla en laboratorio, los procedimientos convencionales de identificación fenotípico son los utilizados más habitualmente para la identificación de las bacterias de las especies del género Streptococcus y de los géneros emparentados, y se han desarrollado varios kits de identificación así como unos autómatas para ayudar a la identificación fenotípica de las bacterias del género Streptococcus y de los géneros emparentados. En este aspecto, el grado de identificación en la práctica corriente es variable. En particular, uno de los ensayos utilizados para la identificación de estreptococos y de bacterias de los géneros emparentados es la observación de una reacción hemolítica, es decir, la destrucción por la bacteria de los hematíes contenidos en un agar sangre. Sin embargo, esta reacción de hemólisis puede ser inhibida por la presencia de oxígeno o por la presencia de peróxido cuando las bacterias estreptococos se cultivan en presencia de una concentración importante de dióxido de carbono. Por otro lado, se reconoce que existe un cierto grado de subjetividad en la apreciación de la hemólisis por las colonias de estreptococos, y por lo tanto una variabilidad de inter-operador que perjudica a continuación la calidad de la identificación de estas bacterias. Para los estreptococos alfa-hemolíticos, un segundo ensayo es el de la sensibilidad a la optoquina, que permite reconocer Streptococcus pneumoniae que es sensible a este compuesto. Sin embargo, se han relacionado unas cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a la optoquina [Lund E. Acta Patho. Microbiol. Immunol. Scand. 1959, 47, 308-315]. Un último ensayo fenotípico es el serotipado, pudiendo este ensayo ser falsamente positivo en particular para los estreptococos de serogrupo D debido a la antigenicidad cruzada entre los estreptococos del grupo D, Enterococcus y Pediococcus.

Se han desarrollado varios sistemas moleculares para la identificación de ciertos serogrupos o de ciertas especies del género Streptococcus, en particular los estreptococos del grupo A (Streptococcus pyogenes, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius) y del grupo B (Streptococcus agalactiae) [Daly J.A. et al. J Clin Microbiol. 1991, 29: 80-82; Heelan J.S. et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 24: 65-69] así como para Streptococcus pneumoniae [Denys G.A. y Carrey R.B. J. Clin. Microbiol. 1992,30: 2725-2727] mediante la hibridación de sondas específicas que tienen por diana el gen que codifica el ARN ribosomal 16S. Asimismo, se han desarrollado diferentes sistemas basados en la amplificación por PCR de genes que codifican para unas toxinas o unos factores de virulencia, para la discriminación de Streptococcus pneumoniae entre los estreptococos a-hemolíticos [Salo P. et al. J. Infect. Dis. 1995, 171: 479-482; Morrisson K. et al. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 434-437; Kaijalainen T. et al. J. Microbiol. Meth. 2002, 51: 111-118], así como para la detección de Streptococcus agalactiae [Mawn J.A. et al. J. Clin. Pathol. 1993, 46: 633-636]. Sin embargo, estos diferentes sistemas permiten la identificación sólo de una o algunas especies del género Streptococcus.