HP90: RECEPTOR DE MEMBRANA ANFITRIONA PARA BACTERIAS PATOGENICAS, CODIFICADAS POR EL GEN TIR BACTERIANO.

Un polipéptido del receptor intimina translocado (Tir) que une la intimina,

en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de

(a) la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO: 4;

(b) una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido Tir tiene un residuo de aminoácido en la SEQ ID NO: 4 sustituido con un aminoácido conservador; y

(c) una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO:4, en donde el polipéptido Tir tiene un aminoácido eliminado de o insertado en la SEQ ID NO: 4

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9801042CA.

Solicitante: THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: 222 HEALTH SCIENCE MALL, I.R.C. BUILDING,VANCOUVER, BRITISH COLUMBIA.

Inventor/es: FINLAY,B.,BRETT BIOTECHNOLOGY LABORATORY, KENNY,BRENDAN BIOTECHNOLOGY LABORATORY, DEVINNEY,REBEKAH BIOTECHNOLOGY LABORATORY, STEIN,MARCUS BIOTECHNOLOGY LABORATORY.

Fecha de Publicación: 24 de Febrero de 2010.

Fecha Concesión Europea: 5 de Agosto de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/24 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Enterobacteriaceae (F), p. ej. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia.

Clasificación PCT:

A61K38/16 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
C07K14/24 C07K 14/00 […] › de Enterobacteriaceae (F), p. ej. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia.
C07K16/12 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales bacterianos.
C12N15/31 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Clasificación antigua:

A61K38/16 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.
C07K14/24 C07K 14/00 […] › de Enterobacteriaceae (F), p. ej. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia.
C07K16/12 C07K 16/00 […] › contra materiales bacterianos.
C12N15/31 C12N 15/00 […] › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.
C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Fragmento de la descripción:

Hp90: Receptor de membrana anfitriona para bacterias patogénicas, codificadas por el gen Tir bacteriano.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona de manera general con la virulencia de organismos patogénicos y más específicamente con factores de virulencia asociados con patógenos de adhesión y eliminación, tal como E. coli enteropatogénica y enterohemorrágica.

Antecedentes de la invención

La Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) es la causa principal de la diarrea en neonatos y es el primer E. coli mostrado por originar gastroenteritis. El EPEC continúa siendo una causa significativa de diarrea en neonatos en las naciones desarrolladas que contribuye a alta morbilidad y mortalidad. El EPEC forma pequeñas microcolonias en la superficie de células epiteliales infectadas seguido por contacto íntimo y degeneración localizada de las microvellosidades de chapa estriada epiteliales, acumuladas en una lesión de adhesión y eliminación (A/E). La lesión A/E (o pedestal) se asocia con el ensamble de estructuras citoesqueléticas altamente organizadas en células epiteliales inmediatamente por debajo de la bacteria adherente que incluye los componentes citoesqueléticos actina, a-actinina, cadena liviana miosina, ezrina, y talina.

El EPEC es un miembro de un grupo de organismos patogénicos, conocidos colectivamente como patógenos de adhesión y eliminación, que adhieren a las células anfitrionas y originan acumulación localizada de actina de anfitriona por debajo de los organismos adherentes. Los patógenos en este grupo incluyen E. coli enterohemorrágica (EHEC, el agente originador de colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico) y varios otros patógenos de humano y animal, que incluyen Citrobacter rodentium y Hafnia alvei.

Un modelo de tres etapas describe la patogenia de la E. coli enteropatogénica. Una adherencia localizada inicial a las células epiteliales, mediada por una fimbria tipo IV, que se sigue por la activación de rutas de transducción de señal de célula epitelial anfitriona y adhesión íntima a las células epiteliales anfitrionas. Estas dos etapas finales se conocen colectivamente cómo adhesión y eliminación. La transducción de señal en las células epiteliales anfitrionas involucra la activación de la actividad quinasa tirosina de célula anfitriona que conduce a la fosforilación de tirosina de una proteína de membrana anfitriona de 90 kilodalton (kDa), Hp90, y flujos de fosfato inositol intracelular (IP3) y calcio. Luego de esta transducción de señal, la bacteria se adhiere íntimamente a la superficie de la célula epitelial, acompañada por daño a las microvellosidades de célula epitelial anfitriona y acumulación de proteínas citoesqueléticas que están por debajo de las bacterias.

Recientemente, se han identificado algunos de los componentes bacterianos involucrados en la formación de pedestal. El EPEC posee un plásmido de virulencia que codifica las fimbrias que forman grupos y un regulador del factor de virulencia positivo. Todos los genes que codifican los productos que son necesarios para la formación de pedestal se encuentran dentro de una isla de patogenicidad de par 35 kilobase (kb) en el cromosoma E. coli. Dentro de la región de Eliminación de Enterocito (LEE) hay varios genes cuyos productos tienen diferentes funciones, que incluyen unas proteínas del aparato de secreción tipo III, moléculas efectoras secretadas y sus chaperones, e intimina.

Los sistemas de secreción tipo III se encuentra crecientemente en muchos organismos gramnegativos patogénicos, y el papel del sistema de secreción tipo III EPEC es secretar proteínas necesarias para la formación de la lesión A/E. Por lo menos dos proteínas secretadas por el sistema de secreción EPEC, EspA y EspB, son necesarias para activar las señales inducidas por EPEC en células epiteliales. Estas señales incluyen flujos de calcio y fosfato de inositol, y la fosforilación de tirosina de Hp90. Las mutaciones en espA o espB, o aquellas en el sistema de secreción tipo III (sep y cfm), son incapaces de señalizar o inducir la unión de la intimina adhesina EPEC a las superficies de células epiteliales.

La intimina es el producto de un lugar LEE cromosómico bacteriano, eaeA, y es una proteína de membrana externa EPEC de 94 kDa necesitada para adherencia íntima. Los mulantes defectuosos en eaeA forman lesiones A/E inmaduras y no organizan las proteínas fosfotirosina y los componentes citoesqueléticos por debajo de las bacterias adherentes, aunque la transducción de señal epitelial todavía se inactiva. La intimina participa en la reorganización del citoesqueleto anfitrión subyacente después de otros factores bacterianos (EspA y EspB) estimulan la transducción de señal epitelial.

La intimina que se une a las células anfitrionas también estimula una segunda onda de transducción de señal dentro de la célula de mamífero, que incluye la fosforilación de tirosina de fosfolipasa C?. En células cultivadas la intimina se une a la forma de tirosina fosforilada de Hp90, pero solo si las células de mamífero se han preinfectado con cepas EPEC que poseen un sistema de secreción tipo III intacto capaz de secretar EspA y EspB. Sin embargo, se conoce poco acerca de la identidad de Hp90 diferente de su tirosina fosforilada luego de la infección EPEC y que, sirve como un receptor para intimina. Las proteínas fosfotirosina (presumiblemente Hp90) se concentran en la punta del pedestal inmediatamente por debajo del EPEC, pero los residuos fosfotirosina no se exponen en la superficie de células no impermeabilizadas. Bioquímicamente, el Hp90 se comporta como una proteína de membrana anfitriona integral, y parece estar altamente conservada. También parece jugar un papel clave en la organización de actina polimerizada bajo la bacteria adherente una vez esta se une a intimina.

Rosenshine et al. (EMBO J. 15, 26 13-2624, 1996) proporciona una investigación en mecanismos de anfitriones activados por E. coli enteropatogénica (EPEC).

La entrada de base de datos EMBL AF025311 en su versión de octubre 28, 1997 describe los genes de proteína chaperona putativa E. Coli y butimina (eaeA).

La entrada de base de datos EMBL U59502 en su versión de Junio 27, 1996 describe la cepa E. coli del gen intimina REPEC 84/110/1 (eaeA).

Resumen de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones.

La presente invención se basa en el descubrimiento que una proteína (Hp90) asociada con la formación de pedestal en bacterias de adhesión y eliminación, a través de su papel como receptor intimina, se produce actualmente por la bacteria de adhesión y eliminación. La presente invención proporciona un polipéptido, llamado Tir (para el receptor intimina translocado) que se secreta por la E. coli patogénica. El diagnóstico de enfermedad originada por la E. coli patogénica se puede desarrollar mediante técnicas estándar, tal como aquellas basadas en el uso de anticuerpos que unen a Tir para detectar la proteína, así como también aquellas basadas en el uso de sondas de ácido nucleico para la detección de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido Tir. La invención también proporciona secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido Tir, péptidos Tir, un método recombinante para producir Tir recombinante, anticuerpos que se unen al Tir, y un equipo para la detección de E. coli que produce Tir. La invención también proporciona usos para inmunizar un anfitrión con Tir para inducir una respuesta inmune protectora a Tin La invención proporciona adicionalmente un método para la detección de compuestos que interfieren con la unión de patógenos bacterianos con sus receptores.

En otro aspecto de la invención, se proporcionan proteínas de fusión. En esta realización, un polinucleótido que codifica Tir se liga operablemente a un segundo polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. En una realización preferida, el segundo polinucleótido de interés codifica un polipéptido que confiere una respuesta inmune, sin embargo, el polipéptido Tir se puede ligar a cualquier segundo polipéptido de interés.

En otra realización, las proteínas de fusión de la invención se suministran en una célula anfitriona.

Se han identificado pocos receptores de mamífero para adhesinas e invasinas bacterianas. Es inesperado el descubrimiento de que Hp90, ahora designado Tir, sea una proteína bacteriana. Todos los datos bioquímicos...

Reivindicaciones:

1. Un polipéptido del receptor intimina translocado (Tir) que une la intimina, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de

(a) la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO: 4;

(b) una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido Tir tiene un residuo de aminoácido en la SEQ ID NO: 4 sustituido con un aminoácido conservador; y

(c) una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO:4, en donde el polipéptido Tir tiene un aminoácido eliminado de o insertado en la SEQ ID NO: 4.

2. El polipéptido Tir de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene adicionalmente una actividad seleccionada del grupo que consiste de

(a) la capacidad para nuclear actina en una célula anfitriona; y

(b) la capacidad para activar una ruta de transducción de señal de célula anfitriona.

3. El polipéptido Tir de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene adicionalmente la capacidad de unir específicamente a un anticuerpo específico Tir.

4. El polipéptido Tir de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene adicionalmente la capacidad de inducir una respuesta inmune en un anfitrión para una E. coli enterohemorrágica.

5. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3;

(b) un polinucleótido de (a), en donde T es U;

(d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO: 4.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.

7. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. Un anticuerpo anti-Tir o un fragmento del mismo que une con alta inmunoespecificidad al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo es monoclonal o policlonal.

10. Un método para detectar un polipéptido Tir en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 8 o 9; y

(b) detectar la unión del anticuerpo a polipéptido Tir, en donde la unión es indicadora de la presencia del polipéptido Tir en la muestra.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la muestra es tejido o un fluido biológico.

12. El método de la reivindicación 10 o 11, en donde la presencia del polipéptido Tir en la muestra es indicadora de infección por una E. coli enterohemorrágica.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6.

14. Uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6 para la preparación de una composición farmacéutica para aliviar una enfermedad originada por infección de un anfitrión mediante un organismo que produce Tir.

15. Uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 6 para la preparación de una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune contra un organismo que produce Tir.

16. El uso de la reivindicación 14 o 15, en donde el anfitrión es humano o bovino.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el organismo que produce Tir es E. coli.

18. El uso de la reivindicación 17, en donde el organismo que produce Tir E. coli es una E. coli enterohemorrágica.

19. Un método para detectar un polinucleótido Tir en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra con una sonda de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones estrictas al polinucleótido de la reivindicación 5; y

(b) detectar hibridación de la sonda con el polinucleótido Tir, en donde la detección de hibridación es indicadora de la presencia del polinucleótido Tir en la muestra, en donde dicha sonda es un fragmento del polinucleótido de la reivindicación 5, que es por lo menos 15 bases de nucleótido de longitud.

20. El método de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente amplificar el polinucleótido Tir.

21. Un método recombinante para producir un polinucleótido Tir, que comprende insertar un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable en el polinucleótido de la reivindicación 5, de tal manera que el polinucleótido resultante codifica un polipéptido Tir recombinante que comprende el marcador seleccionable.

22. Un método recombinante para producir un polipéptido Tir, que comprende:

(a) hacer crecer una célula anfitriona recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 que codifica un polipéptido Tir bajo condiciones que permiten la expresión y secreción del polipéptido Tir; y,

(b) aislar el polipéptido Tir.

23. Un método para producir una proteína de fusión Tir que comprende:

(a) hacer crecer una célula anfitriona que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido Tir de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ligada operablemente a un polinucleótido que codifica un polipéptido o péptido de interés bajo condiciones que permiten la expresión y secreción de la proteína de fusión; y

(b) aislar la proteína de fusión.

24. Una proteína de fusión Tir producida por el método de la reivindicación 23, en donde el polipéptido de fusión Tir comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 fusionada a una secuencia de proteína sin Tir,

25. Un método para identificar un compuesto que interfiere con la unión de un polipéptido Tir de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con la intimina, el método comprende comparar la unión del polipéptido Tir con intimina en la presencia del compuesto con la unión del polipéptido Tir en la ausencia del compuesto.

26. Un método para diferenciación entre patógenos de adhesión y eliminación, que comprende:

(a) poner en contacto la bacteria de adhesión y eliminación obtenida de una célula anfitriona infectada con un anticuerpo de la reivindicación 8 o 9; y

(b) poner en contacto la bacteria de adhesión y eliminación con un anticuerpo antifosfotirosina.

27. Uso de un vehículo de suministro celular que contiene intimina que comprende un compuesto de interés para la fabricación de una composición cosmética o farmacéutica para suministrar un compuesto de interés a una célula que contiene un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

28. Un método para detectar el citoesqueleto de una célula, que comprende:

(a) poner en contacto un citoesqueleto de célula con un polipéptido Tir de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y

(b) detectar la unión de dicho Polipéptido Tir con el citoesqueleto de la célula.

29. Un equipo útil para la detección de un polipéptido Tir que comprende medios portadores que se compartimentalizan para recibir en confinamiento cerrado allí de uno o más recipientes que comprenden un recipiente que contiene un anticuerpo de la reivindicación 2 o 9 que une al polipéptido Tir.

30. El equipo de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo se marca detectablemente.

31. El equipo de la reivindicación 30, en donde la marca se selecciona del grupo que consiste de radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metal, y una enzima.

32. Un equipo útil para la detección de un polinucleótido Tir que comprende medios portadores que se compartimentalizan para recibir en confinamiento cerrado allí de uno o más recipientes que comprenden un recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que hibrida al polinucleótido de la reivindicación 5, en donde dicha sonda contiene por lo menos 35 nucleótidos.

33. El equipo de la reivindicación 32, en donde la sonda se marca detectablemente.

34. El equipo de la reivindicación 33, en donde la marca se selecciona del grupo que consiste de radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metal, y una enzima.

35. Un equipo útil para la detección de un polinucleótido Tir que comprende medios portadores que se compartimentalizan para recibir en confinamiento cerrado allí de dos o más recipientes que comprenden:

(a) un primer recipiente que contiene una primera sonda de ácido nucleico que hibrida a una de las dos hebras del polinucleótido de la reivindicación 5, y

(b) un segundo recipiente que contiene una segunda sonda de ácido nucleico que hibrida a la otra de las dos hebras del polinucleótido, de la reivindicación 5, en donde dicha primera sonda y dicha segunda sonda contienen por lo menos 12 nucleótidos y en donde, la hibridación es bajo condiciones altamente exigentes,

36. Una bacteria atenuada, en donde la bacteria carece de una proteína EspA o EspB y en donde la bacteria comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ligada operablemente al polipéptido de interés para inducir una respuesta inmune mediada por célula a un polipéptido de interés.

37. La bacteria atenuada de la reivindicación 36, en donde el polipéptido de interés es un antígeno.

38. La bacteria atenuada de la reivindicación 36 o 37, en donde la bacteria es E. coli.

39. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde la composición induce una respuesta inmune contra un E. coli que produce Tir.

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