Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos con de cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae.

Microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de L-treonina o L-triptófano, en losque se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de almenos 5 95% con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID No.

16, presentando el polipéptido la actividadde glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP), en donde

a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gendel operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, lahomoserina quinasa y la treonina sintasa, y

b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos ungen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa,la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y latriptófano-sintasa.

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos con de cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae Esta invención se refiere a un procedimiento para la preparación de L-treonina y L-triptófano utilizando microorganismos recombinantes de la familia Enterobacteriaceae, en los que el gen glpK está potenciado, en particular sobre-expresado, y que muestran una capacidad mejorada para el aprovechamiento de glicerol y, con ello, para la formación y acumulación de los L-aminoácidos, así como a estos microorganismos.

Estado conocido de la técnica L-aminoácidos, en particular L-treonina y L-triptófano, encuentran aplicación en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y, de manera muy particular, en la alimentación de animales.

Es conocido que L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a la gran importancia, se trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de preparación. Mejoras en el procedimiento pueden afectar a medidas técnicas de la fermentación tales como, p. ej., agitación y abastecimiento de oxígeno, o a la composición de los medios nutricios tales como, p. ej., la concentración de azúcares durante la fermentación, o el tratamiento para dar la forma de producto, p. ej. mediante cromatografía de intercambio de iones, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se emplean métodos de la mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes frente a anti-metabolitos tales como, p. ej., el análogo de treonina ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHV) o son auxótrofos para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos tales como, p. ej., L-treonina. La resistencia frente al análogo de triptófano 5-metil-DL-triptófano (5-MT) distingue, p. ej., por una cepa que produce L-triptófano.

Desde hace algunos años se emplean asimismo métodos de la técnica de ADN recombinante para la mejora de las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriaceae, amplificando genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales y examinando el efecto sobre la producción. Informaciones recopilatorias para la biología celular y molecular de Escherichia coli y Salmonella se pueden encontrar en Neidhardt (comp.) : Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2ª edición, ASM Press, Washington, D. C., EE.UU., (1996) .

Toda la industria de fermentación para la preparación de L-aminoácidos discurre hoy en día la mayoría de las veces en base a glucosa o sacarosa como fuente de carbono que se obtienen en el tratamiento de productos agrarios. Sin embargo, dado que aumenta el precio de estas fuentes de carbono, es deseable una alternativa tecnológicamente factible para la producción de los L-aminoácidos, preferiblemente L-treonina y L-triptófano, un aprovechamiento mejorado de un material más económico como materia prima alternativa para la fermentación.

Es conocido que microorganismos productores de L-aminoácidos se desarrollan sobre glicerol como única fuente de carbono (documento US-A-5.175.107) . Glicerol (propanotriol) es un componente natural de aceites y grasas y une en forma de “puente” las moléculas de ácidos grasos en los triglicéridos. La molécula de glicerol es fuertemente polar y, por lo tanto, bien soluble en agua. Como producto de acoplamiento, esta materia prima valiosa se forma en la preparación de biodiesel (éster metílico de colza) y se emplea en productos cosméticos, productos farmacéuticos, alimentos y para aplicaciones técnicas. Decisivo para el empleo de glicerol como materia prima para la preparación de componentes de alimentos para animales es su buen precio. Se ha de partir del hecho de que con la producción creciente de biodiesel, el glicerol se vuelve más interesante para el sector de los alimentos para animales.

Misión de la invención Los autores de la invención se han propuesto proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-treonina y L-triptófano.

Descripción de la invención Objeto de la invención son microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de Ltreonina o L-triptófano, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95%, preferiblemente de al menos 98%, de manera particularmente preferida de al menos 99%, y de manera muy particularmente preferida de 100%, con la secuencia de aminoácidos conforme a 2 SEQ ID No. 16, presentando el polipéptido la actividad de glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP) , en donde a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, la homoserina quinasa y la treonina sintasa, y

b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa.

Como punto de partida para la comparación sirven en cada caso los microorganismos no recombinantes para el gen a potenciar que contienen al gen respectivo no en forma potenciada y en los que se pueden llevar a cabo las medidas de la invención.

A estos microorganismos pertenecen, en particular, microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente se sobre-expresa al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95%, preferiblemente de al menos el 98%, de manera particularmente preferida de al menos el 99% y de manera muy particularmente preferida del 100%, con una secuencia de aminoácidos elegida del grupo SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID

No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36 y SEQ ID No. 38.

Los microorganismos de acuerdo con la invención contienen preferiblemente al menos un polinucleótido sobreexpresado que codifica un polipéptido con la actividad de la glicerol quinasa GlpK dependiente de ATP, seleccionado del grupo a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, b) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO: 15 en el marco de la degeneración del código genético,

c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 15, alcanzándose las condiciones rigurosas mediante una 30 etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0, 1 SSC.

Los microorganismos mencionados contienen, además, preferiblemente al menos un polinucleótido potenciado o sobre-expresado, elegido del grupo:

a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37;

b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37 en el marco de la degeneración del código genético;

c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o 50 SEQ ID No. 37, alcanzándose las condiciones rigurosas preferiblemente mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0, 1xSSC;

en donde los polinucleótidos codifican enzimas del metabolismo... [Seguir leyendo]

1. Microorganismos de la especie Escherichia coli recombinantes, productores de L-treonina o L-triptófano, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ ID No. 16, presentando el polipéptido la actividad de glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP) , en donde a) en los microorganismos productores de L-treonina se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón thrABC, que codifica la aspartato quinasa, la homoserina-deshidrogenasa, la homoserina quinasa y la treonina sintasa, y

b) en los microorganismos productores de L-triptófano se potencia o sobre-expresa al menos un gen del operón triptófano que codifica la antranilato-sintasa, la antranilatofosforribosiltransferasa, la fosforribosilantranilato-isomerasa, la indol-3-glicerolfosfato-sintasa y la triptófano-sintasa.

2. Microorganismos recombinantes según la reivindicación 1, en los que adicionalmente se sobre-expresa al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácidos, seleccionada del grupo:

a) SEQ ID NO: 2, en donde el polipéptido cumple la función de la sub-unidad grande de la sn-glicerol-3fosfato-deshidrogenasa (anaerobia) , b) SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad para el anclaje a la membrana de la sn-glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa (anaerobia) , c) SEQ ID NO: 6, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad pequeña de la sn-glicerol-3fosfato-deshidrogenasa (anaerobia) , d) SEQ ID NO: 8, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-3-fosfato-dehidrogenasa (aerobia) , e) SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido presenta la actividad de la azufre transferasa, f) SEQ ID NO: 12, en donde el polipéptido presenta la actividad del facilitador de glicerol GlpF, g) SEQ ID NO: 14, h) SEQ ID NO: 18, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol fosfodiesterasa periplasmática, i) SEQ ID NO: 20, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-3-fosfato-permeasa, j) SEQ ID NO: 22, en donde el polipéptido presenta la actividad de la fructosa -1, 6-bisfosfatasa II, k) SEQ ID NO: 24, en donde el polipéptido presenta la actividad de la triosafosfato-isomerasa, l) SEQ ID NO: 26, en donde el polipéptido presenta la actividad de la glicerol-deshidrogenasa (dependiente de NAD) , m) SEQ ID NO: 28, en donde el polipéptido cumple la función del dominio N-terminal de la dihidroxiacetonaquinasa, n) SEQ ID NO: 30, en donde el polipéptido cumple la función del dominio C-terminal de la dihidroxiacetonaquinasa, o) SEQ ID NO: 32, en donde el polipéptido cumple la función de la subunidad de la proteína PTS de la dihidroxiacetona-quinasa, p) SEQ ID NO: 34, en donde el polipéptido cumple la función del activador del operón dha, q) SEQ ID NO: 36, en donde el polipéptido cumple la función de la fructosa-6-fosfato-aldolasa I, y r) SEQ ID NO: 38, en donde el polipéptido cumple la función de la fructosa-6-fosfato-aldolasa II.

3. Microorganismos según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados por que los polipéptidos presentan secuencias de aminoácidos que tienen una identidad del 100% con una de las secuencias elegidas del grupo: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36 y SEQ ID No. 38.

4. Microorganismos según la reivindicación 1, caracterizados por que contienen al menos un polinucleótido sobreexpresado que codifica un polipéptido con la actividad de la glicerol quinasa GlpK dependiente de ATP, seleccionado del grupo: a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, b) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos que corresponde a la SEQ ID NO: 15 en el marco de la

degeneración del código genético,

c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la SEQ ID NO: 15, alcanzándose las condiciones rigurosas mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0, 1 SSC.

5. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados por que contienen al menos un polinucleótido potenciado o sobre-expresado, elegido del grupo:

a) polinucleótido con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37;

b) polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que corresponde a SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37 en el marco de la degeneración del código genético;

c) secuencia de polinucleótidos con una secuencia que se hibrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35 o SEQ ID No. 37, alcanzándose las condiciones rigurosas preferiblemente mediante una etapa de lavado en la que la temperatura se extiende a lo largo de un intervalo de 64ºC a 68ºC y la concentración de sales del tampón se extiende a lo largo de un intervalo de 2xSSC a 0, 1xSSC.

6. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que se preparan mediante transformación, transducción, conjugación o mediante una combinación de estos métodos, con un vector que contiene al menos uno o varios de los polinucleótidos mencionados, o sus alelos y/o un promotor.

7. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 6, en los que el número de copias de al menos uno de los polinucleótidos o de los alelos de los mismos se presenta incrementado en al menos 1, comparado con el microorganismo o cepa parental no recombinante.

8. Microorganismos según la reivindicación 7, en los que el número de copias incrementado en al menos 1 se consigue mediante integración del gen o de los alelos en el cromosoma de los microorganismos.

9. Microorganismos según la reivindicación 7, caracterizados por que el aumento del número de copias 1 se alcanza mediante un vector que se replica de forma extracromosómica.

10. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados por que para alcanzar

la potenciación a) se incorporan casetes de expresión o promotores aguas arriba de al menos uno de los polinucleótidos mencionados.

11. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados por que la expresión de al menos uno de los polinucleótidos mencionados se encuentra bajo el control de un promotor que potencia la expresión del gen.

12. Microorganismos según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados por que mediante la potenciación de al menos uno de los polinucleótidos mencionados se aumenta en al menos un 10% la concentración o actividad del respectivo producto GlpK (proteína) codificado, referido a la actividad o concentración del producto génico en el microorganismo o cepa parental no recombinante referido al polinucleótido.

13. Procedimiento para la preparación de L-treonina o L-triptófano mediante fermentación de microorganismos recombinantes de la especie Escherichia coli, caracterizado por que a) los mencionados microorganismos productores del L-aminoácido, en los que se potencia o sobre-expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, presentando el polipéptido la actividad de la glicerol quinasa GlpK (dependiente de ATP) se cultiva en un medio que contiene una o varias fuentes de C bajo condiciones en las que el Laminoácido mencionado se acumula en el medio o en las células, y

b) se aísla el L-aminoácido mencionado, en donde la biomasa en su conjunto o porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que a) los microorganismos productores del L-aminoácido mencionado según las reivindicaciones 1 a 12 se cultivan en un medio que contiene una o varias fuentes de C bajo condiciones en las que el

L-aminoácido mencionado se acumula en el medio o en las células, y b) se aísla el L-aminoácido mencionado, en donde la biomasa en su conjunto o porciones permanecen en el producto aislado o se separan por completo.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por que como fuente de C se emplea ≥ 50 a 100% de glicerol.

16. Procedimiento según las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado por que microorganismos según la reivindicación 2.k) , 2.m) a 2.r) se cultivan en un medio de fermentación exento de glicerol.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que para la preparación de L-treonina se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se sobre-expresa uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

a) el gen pyc que codifica la piruvato-carboxilasa de Cor y nebacterium glutamicum,

b) el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa,

c) el gen ppc que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxilasa,

d) los genes pntA y pntB que codifican las subunidades de la piridina-transhidrogenasa,

e) el gen rhtC que codifica la proteína inductora de resistencia a treonina,

f) el gen thrE de Cor y nebacterium glutamicum que codifica la proteína de exportación-soporte de treonina,

g) el gen gdhA que codifica la glutamato-deshidrogenasa,

h) el gen ptsH que codifica la fosfohistidina-proteína-hexosa-fosfotransferasa,

i) el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,

j) el gen crr que codifica el componente IIA específico para glucosa,

k) el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico para glucosa,

l) el gen cysK que codifica la cisteína-sintasa A,

m) el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,

n) el gen cysJ que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

o) el cen cysI que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa,

p) el gen cysH que codifica la adenililsulfato-reductasa,

q) el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de la 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

r) el gen sucB que codifica la subunidad E2 de dihidrolipoiltranssuccinasa de la 2-cetoglutarato

deshidrogenasa,

s) el gen sucC que codifica la subunidad β de la succinil-CoA-sintetasa,

t) el gen sucD que codifica la subunidad α de la succinil-CoA-sintetasa, y

u) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yibD de Escherichia coli.

18. Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que para la preparación de L-triptófano se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se sobre-expresa uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

a) el gen serA que codifica la 3-fosfoglicerato-deshidrogenasa, b) el gen serB que codifica la fosfoserinafosfatasa, c) el gen serC que codifica la fosfoserina-aminotransferasa, d) el gen aroF que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-tirosina, e) el gen aroG que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-fenilalanina, f) el gen aroH que codifica la DHAP-sintasa sensible a L-triptófano, g) el gen pps que codifica la fosfoenolpiruvato-sintasa, h) el gen pckA que codifica la fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa, i) el gen tktA que codifica la transcetolasa A, j) el gen tktB que codifica la transcetolasa B, y k) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yddG de Escherichia coli. 19. Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por que para la

preparación de L-treonina se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se elimina o se reduce la expresión de uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

a) el gen tdh que codifica la treonina-deshidrogenasa, b) el gen mdh que codifica la malato-deshidrogenasa, c) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) yjfA de Escherichia coli, d) el producto génico del marco de lectura abierto (ORF) ytfP de Escherichia coli, e) el gen pckA que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa, f) el gen poxB que codifica la piruvato-oxidasa, g) el gen dgsA que codifica el regulador de DgsA del sistema de fosfotransferasa, h) el gen fruR que codifica el represor de fructosa, i) el gen rpoS que codifica al factor Sigma38, j) el gen aspA que codifica la aspartato amonio-liasa, y k) el gen glpR que codifica el represor del regulón de glp. 20. Procedimiento según las reivindicaciones 13 a 16 y 18, caracterizado por que para la

preparación de L-triptófano se fermentan microorganismos de la especie Escherichia coli, en los que adicionalmente al mismo tiempo se potencia, en particular se elimina o se reduce la expresión de uno o varios de los genes seleccionados del grupo:

a) el gen tnaA que codifica la triptofanasa, b) el gen trpR que codifica el represor del operón trp, c) el gen tyrA que codifica la corismato-mutasa T y prefenato-deshidrogenasa, d) el gen pheA que codifica la corismato-mutasa P y prefenato-deshidrogenasa,

e) el gen mtr que codifica la proteína de transporte específica para triptófano,

f) el gen tnaB que codifica la triptófano-permeasa,

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g) el gen aroP que codifica el transportador para aminoácidos aromáticos,

h) el gen sdaA que codifica la L-serina desaminasa,

10 i) el gen pgi que codifica la glucosa-6-fosfato-isomerasa,

j) el gen tyrB que codifica la tirosina-aminotransferasa, y

k) el gen glpR que codifica el represor del regulón glp.

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