TRATAMIENTO DEL MELANOMA MEDIANTE LA REDUCCIÓN DE LOS NIVELES DE CLUSTERINA.

Uso de una composición que comprende un agente terapéutico en forma de un oligodesoxinucleótido antisentido u oligonucleótido de ARNip dirigido al gen de la clusterina o un anticuerpo dirigido a la clusterina y eficaz para reducir la cantidad eficaz de clusterina en células de melanoma para la formulación de una composición farmacéutica para el tratamiento del melanoma

Esta solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de las solicitudes estadounidenses provisionales n.os 60/405.193 presentada el 21 de agosto de 2002, 60/408.152 presentada el 3 de septiembre de 2002, 60/319.748 presentada el 2 de diciembre de 2002 y 60/472.387 presentada el 20 de mayo de 2003.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud se refiere a tratamientos para melanoma mediante la inhibición de clusterina, también conocida como mensaje 2 de próstata inhibido por testosterona (TRPM-2), por ejemplo mediante la administración de oligonucleótidos antisentido específicos para clusterina.

La clusterina o TRPM-2 es una proteína ubicua, con una diversa gama de actividades propuestas. En las células epiteliales de próstata, la expresión de clusterina aumenta inmediatamente tras la castración, alcanzando niveles máximos en células de próstata de rata a los 3 a 4 días tras la castración, coincidente con el inicio de la muerte celular masiva. Estos resultados han conducido a algunos investigadores a la conclusión de que la clusterina es un marcador para la muerte celular, y un promotor de la apoptosis. Por otra parte, la observación de que las células de Sertoli y algunas células epiteliales expresan altos niveles de clusterina sin aumento de los niveles de muerte celular plantea preguntas en cuanto a si esta conclusión es correcta. Sensibar et al., Cancer Research

55: 2431-2437 (1995) notificó en experimentos in vitro realizados para esclarecer más claramente el papel de la clusterina en la muerte celular prostática. Utilizaron células LNCaP transfectadas con un gen que codifica para clusterina y observaron si la expresión de esta proteína alteraba los efectos

del factor de necrosis tumoral  (TNF), al que las células LNCaP son muy sensibles, produciéndose la muerte celular normalmente en un plazo de aproximadamente 12 horas. Se demostró que el tratamiento de las células LNCaP transfectadas con TNF da como resultado un aumento transitorio en los niveles de clusterina durante un periodo de unas pocas horas, pero estos niveles se habían disipado para el momento en que se observaba la fragmentación de ADN que precedía a la muerte celular. El uso de una molécula antisentido correspondiente a las bases 1-21 de la secuencia de clusterina, pero no otros oligonucleótidos antisentido de clusterina, dio como resultado una reducción sustancial en la expresión de clusterina, y un aumento en la

muerte celular apoptótica en las células LNCaP expuestas a TNF. Esto condujo a Sensibar et al. a la hipótesis de que la sobreexpresión de clusterina podría proteger las células del efecto citotóxico del TNF, y que el agotamiento responsable del inicio de la muerte celular, aunque el mecanismo de acción sigue siendo poco claro.

La publicación PCT WO00/049937 describe el uso de terapia antisentido que reduce la expresión de clusterina para proporcionar beneficios terapéuticos en el tratamiento del cáncer de cáncer de próstata, cáncer de células renales y algunos cánceres de mama. Además, el uso combinado de la clusterina antisentido más quimioterapia citotóxica (por ejemplo, taxanos) potencia de manera sinérgica la quimiosensibilidad en el cáncer de próstata resistente a hormonas. La sensibilidad a la radiación también se potencia cuando se tratan células que expresan clusterina con oligodesoxinucleótidos (ODN) de clusterina antisentido.

Sumario de la invención

La presente solicitud se refiere al tratamiento de melanoma mediante la reducción de la cantidad eficaz de clusterina. Por tanto, según un aspecto de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de melanoma en un sujeto mamífero, preferiblemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar al sujeto un agente terapéutico eficaz para reducir la cantidad eficaz de clusterina en las células de melanoma. El

agente terapéutico puede ser, por ejemplo, un compuesto de ODN antisentido o de ARN inhibitorio pequeño (ARNip) dirigido a clusterina.

La presente invención también proporciona un método para regular la expresión de bcl-xL en un sujeto o una línea celular que comprende administrar al sujeto o la línea celular un agente eficaz para modular la cantidad de la expresión de clusterina. En particular, en células que expresan clusterina, la expresión de bcl-xL se regula por disminución cuando se reduce la cantidad eficaz de clusterina. Tal inhibición es significativa porque se conoce que el bcl-xL actúa como un inhibidor de la apoptosis. Véase por ejemplo la patente estadounidense n.º 6.172.216.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados cuando se trataron células de melanoma 607B con o bien el oligonucleótido antisentido a concentraciones de 100, 250 ó 500 nM, o bien un control de apareamiento erróneo aletorizado a una concentración de 100 nM en dos días consecutivos.

La figura 2 proporciona representaciones gráficas de la expresión de clusterina en células 518A2 tras el tratamiento con cisplatino y o bien un oligonucleótido antisentido o bien un control de apareamiento erróneo, aleatorizado.

La figura 3 muestra la supervivencia celular de células de melanoma Mel Juso transfectadas de manera estable con o bien un vector de control vacío (Neo) o bien un vector que dirige la sobreexpresión de clusterina, que se cultivaron en medio que

contenía cisplatino 10 M.

Descripción de la invención

Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones de esta solicitud, el término “clusterina” se refiere a la glicoproteína originalmente derivada de testículos de rata, y a proteínas homólogas derivadas de otras especies de mamíferos, incluyendo seres humanos, tanto si se denomina clusterina como con un nombre alternativo. Se conocen las

secuencias de numerosas especies de clusterina. Por ejemplo, se notifica la secuencia de la clusterina humana en Wong et al., Eur. J. Biochem. 221 (3), 917-925 (1994), y en el número de registro de la secuencia del NCBI NM_001831 y se muestra en la lista de secuencias como SEQ ID NO: 1. En esta secuencia, la secuencia codificante abarca las bases 48 a 1397.

La presente invención proporciona una composición terapéutica, y métodos para usar una composición de este tipo para el tratamiento de melanoma, particularmente en seres humanos. Las composiciones terapéuticas y los métodos de la invención logran una reducción de la cantidad eficaz de clusterina presente en el individuo que está tratándose. Tal como se usa en esta solicitud, la “cantidad eficaz de clusterina” es la cantidad de clusterina que está presente en una forma que es funcional para proporcionar protección antiapoptótica. La cantidad eficaz de clusterina puede reducirse disminuyendo la tasa de expresión de clusterina, aumentado la tasa de degradación de clusterina, o modificando la clusterina (por ejemplo, mediante la unión con un anticuerpo) de tal manera que se vuelve inactiva.

Agentes terapéuticos de ODN antisentido

En una realización de la invención, puede lograrse la reducción de la cantidad eficaz de clusterina mediante la administración de ODN antisentido, particularmente ODN antisentido que son complementarios a una región del ARNm de clusterina que abarca o bien el sitio de iniciación de la traducción o bien el sitio de terminación. Las secuencias a modo de ejemplo que pueden emplearse como moléculas antisentido en el método de la invención se dan a conocer en la publicación de patente PCT WO 00/49937, la publicación de patente estadounidense US-2002-0128220-A1, y la patente estadounidense n.º 6.383.808. Las secuencias antisentido específicas se muestran en la presente solicitud como las SEQ ID NO: 2 a 12.

Pueden modificarse los ODN empleados para aumentar la estabilidad del ODN in vivo. Por ejemplo, pueden emplearse los ODN como derivados de fosforotioato (sustitución de un átomo de

oxígeno de fosforilo que no forma puentes por un átomo de azufre) que tienen resistencia aumentada a la digestión con nucleasas. También es eficaz la modificación con MOE (2'-O-(2metoxietilo) (estructura principal ISIS). La construcción de tal ODN modificado se describe en detalle en la solicitud de patente estadounidense 10/080.794. Una composición particularmente preferida es un oligonucleótido de 21 meros (cagcagcagagtcttcatcat; SEQ...

1. Uso de una composición que comprende un agente terapéutico en forma de un oligodesoxinucleótido antisentido u oligonucleótido de ARNip dirigido al gen de la clusterina o un anticuerpo dirigido a la clusterina y eficaz para reducir la cantidad eficaz de clusterina en células de melanoma para la formulación de una composición farmacéutica para el tratamiento del melanoma.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico es un oligodesoxinucleótido antisentido.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el oligodesoxinucleótido antisentido abarca o bien el sitio de iniciación de la traducción o bien el sitio de terminación.

4. Uso según la reivindicación 2 ó 3, en el que se modifica el oligodesoxinucleótido antisentido para potenciar su estabilidad in vivo en relación con un oligodesoxinucleótido no modificado de la misma secuencia.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la modificación es una modificación con (2'-O-(2-metoxietilo).

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que el oligodesoxinucleótido antisentido consiste esencialmente en un oligodesoxinucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a 12.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el oligodesoxinucleótido antisentido consiste en la SEQ ID NO:

4.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el oligodesoxinucleótido tiene una estructura principal de fosforotioato en su totalidad, los restos de azúcares de los nucleótidos 1-4 y 18-21, las “alas”, llevan modificaciones con 2'-O-metoxietilo y los nucleótidos restantes son 2'-desoxinucleótidos.

9. Uso según la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico es una molécula de ARN eficaz para reducir la cantidad eficaz de clusterina en las células de melanoma mediante un mecanismo de iARN. 10. Uso según la reivindicación 9, en el que la molécula de ARN comprende un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 a 43 o una molécula de ARN bicatenario que comprende un oligonucleótido seleccionado 5 del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 a 43 como una cadena. 11. Uso según la reivindicación 9, en el que la molécula de ARN consiste en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 a 43 o una molécula de ARN 10 bicatenario que contiene un oligonucleótido que consiste en un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 a 43 como una cadena.