Proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) como sensibilizantes quimioterapéuticos.

Un polipéptido aislado seleccionado de los aminoácidos 17-153 de SEC ID Nº 10,

en el que el polipéptido consiste en las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9, o en el que el polipéptido consiste en fragmentos, variantes o análogos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % con las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9, o en el que el polipéptido consiste en las SEC ID Nº 8 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo carboxilo de la SEC ID Nº 8, o consiste en la SEC ID Nº 9 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo amino o en el extremo carboxilo o en ambos extremos de la SEC ID Nº 9, en el que el polipéptido aislado tiene actividad sensibilizante a la terapéutica para el cáncer.

Proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) como sensibilizantes quimioterapéuticos Campo de la invención La invención se refiere a composiciones sensibilizantes de terapia del cáncer y a procedimientos, específicamente polipéptidos y polinucleótidos relacionados con la proteína SPARC y el gen SPARC.

Antecedentes de la invención El cáncer es una de las principales causas de muerte en seres humanos y, aunque la quimioterapia, la radioterapia y la intervención quirúrgica convencionales reducen con éxito la carga tumoral en muchos casos, la resistencia a la intervención quimioterapéutica no es poco frecuente, especialmente en tumores sólidos. La resistencia se desarrolla tras la exposición a la quimioterapia y además impide la regresión y la cura del tumor. Es esta resistencia quimioterapéutica que conduce al fracaso del tratamiento lo que da lugar a las elevadas tasas de mortalidad en el cáncer.

La base molecular de la resistencia quimioterapéutica es principalmente genética y puede tomar muchas formas. Muchas mutaciones responsables del desarrollo inicial de los tumores pueden también contribuir a la resistencia a los fármacos. Por ejemplo, la pérdida de la función génica de reparación de los apareamientos erróneos del ADN (MMR) se ha asociado con una aparición más rápida de la resistencia farmacológica clínica en algunos cánceres (de las Alas M.M., et al., 1997. J Natl Canc Inst 89:1537-41; Lin X. y Howell, S.B. 1999. Mol Pharmacol 56:390-5) y las mutaciones en el gen K-ras (que se encuentra en aproximadamente el 40 % de los pólipos adenomatosos y adenocarcinomas) se asocian con un incremento de la tasa de recaídas, la mortalidad y mala respuesta a la quimioterapia (Arber N. y col. 2000, Gastroenterology 118:1045-1050) . La expresión aberrante y la regulación alterada de las proteínas implicadas en el ciclo de replicación celular normalmente estrechamente regulado puede también proteger frente a tumores, en la bibliografía se puede hacer referencia libremente a estas proteínas como “oncogenes”. Por ejemplo, se ha demostrado que los productos génicos p21 y p27 protegen a los tumores de la apoptosis provocada por varios agentes anticancerosos (Waldman T. et al., 1996. Uncoupling of S phase and mistosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature 381:713 716; St. Croix B. et al., 1996. Nature Med 1996, 2:1204-1210) . Las moléculas de adhesión, como la E-cadherina, pueden también conferir resistencia a las células expuestas a agentes quimioterapéuticos (Skoudy A, y col., 1996. Biochem J 317: 279-84.) . Los mecanismos implicados en la resistencia terapéutica son variados y pueden ser muy complejos.

Los quimiosensibilizantes pueden actuar junto con el agente quimioterapéutico o pueden servir para contrarrestar los mecanismos de resistencia en la célula. Los quimiosensibilizantes existentes incluyen fármacos de moléculas pequeñas, tales como fotosensibilizantes o inhibidores de la bomba de salida de fármaco y, más recientemente, oligonucleótidos antisentido. Nuevos compuestos con actividad quimiosensibilizante se incluyen en los documentos US5776925 y WO 02/00164, que proporcionan ejemplos de nuevos compuestos químicos que potencian la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos.

El documento US6001563 proporciona un procedimiento para identificar compuestos químicos que pueden tener actividad quimiosensibilizante.

Las secuencias antisentido con actividad quimiosensibilizante, que a menudo están dirigidos específicamente a oncogenes, son variadas y se pueden encontrar para casi cualquier diana. Por ejemplo, la survivina es una proteína que modula la apoptosis y con frecuencia se sobreexpresa en las células de cáncer (Krajewska, M. y col., 2003. Clin Cancer Res 9:4914; Kaur, P. y col., 2004. Arch Pathol Lab Med 128:39; Shariat, S.F. y col., 2004. La detección en orina de la survivina es un marcador sensible para el diagnóstico no invasivo del cáncer de vejiga. J Urol 171: 626) . Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido de la survivina regulan por disminución la expresión de la survivina y sensibilizan a las células a los agentes quimioterapéuticos tales como docetaxel y etopótido (Hayashi, N. y col., 2005. Prostate 15:10-19) .

De un modo similar, los sensibilizantes al tratamiento contra el cáncer pueden actuar junto con agentes quimioterapéuticos, por ejemplo radioterapia, o pueden servir para contrarrestar los mecanismos de resistencia en la célula al agente terapéutico para el cáncer.

La proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC) es un ejemplo de un gen con expresión significativamente disminuida en líneas celulares resistentes a múltiples fármacos in Vitro, con un posible papel supresor tumoral (Tai,

I.T. y col., 2005. J. Clin Invest. 115:1492-1502) . La SPARC, también conocida como osteonectina, pertenece a una familia de proteínas matricelulares que tienen propiedades de contraadhesión, que rompe las interacciones célulamatriz (Bornstein P. 1995. J.Cell Biol 130:503-6; Sage E. H. and Bornstein P. 1991. J Biol Chem; 266:14831-4) .

Se ha demostrado que la SPARC desempeña un papel en la mineralización ósea, remodelado tisular, migración de células endoteliales, morfogénesis y angiogénesis (Latvala T. y col., 1996. Exp Eye Res. 63:579-84; Hasselaar P. y Sage EH. 1992. J Cell Biochem. 49:272-83; Mason I.J. y col., 1986. EMBO J. 5:1831-7; Strandjord T.P. y col., 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13:279-87; Kupprion C, y col., 1998.J Biol Chem. 273:29635-40; Lane T.F. y col., 1994. J Cell Biol. 125: 929-43) .

Se describen algunos péptidos en N-terminal y C-terminal de la SPARC murina que bloquean la actividad antidiseminación mediada por SPARC en células endoteliales aórticas bovinas en cultivo (Lane TF y Sage, EH 1990, J. Cell Biol 111:3065-3076) .

Un péptido correspondiente a un segmento del dominio de la folistatina inhibe la migración de las células endoteliales in vitro y la angiogénesis en un modelo de ensayo corneado en ratas (Chlenski y col., 2004. Cancer Res. 64:7420-7425)

Algunos péptidos corresponden a la región catiónica de la SPARC murina y actúan como estimuladores del crecimiento de capilares in vitro e in vivo. No obstante, la actividad de unión a Cu2+solo no parece ser suficiente para que un péptido estimule la angiogénesis (Lane y col., 1994. J Cell B iol 125:929-943) .

Estudios adicionales sugieren que la escisión de la SPARC por la MMP-3 da como resultado péptidos que afectan a la angiogénesis (Sage y col., 2003 J. Biol Chem 287: 37849-37857) .

La SPARC tiene también un papel en la neoplasia maligna, dado que la expresión génica y proteica variable de la SPARC se ha vinculado a la progresión del cáncer en una serie de tumores (Yiu, G.K., y col., 2001. Am J.Pathol 159:609-622; Rempel S.A. y col., 2001. J Neurooncol 53:149-60; Schultz C. y col., 2002. Cancer Res 62:6270-7; .Porter P.L. y col., 1995. J Histochem Cytochem 43:791-800) . Los estudios en animales defectivos en SPARC revelan que la pérdida de SPARC potencia el crecimiento de xenoinjertos tumorales de cánceres pancreáticos y de pulmón (Puolakkainen P.A. y col., 2004. Mol Cancer Res 2:215-24; Brekken R.A. y col., 2003. J Clin Invest111:48795) (documentos WO 2006/112930 A; EP 1 033 401 A; Base de datos de EMBL 19 de julio de 2005, Osada, N. y col., "clone: QccE10162, similar to human", Acc. No. Q4R5R0, recuperado de EBI) .

El uso de la proteína SPARC intacta aislada como quimiosensibilizante se describe en el documento WO 2004/064785.

Sumario de la invención De acuerdo con una realización de la invención, como se define en las reivindicaciones, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 o la SEC ID Nº 6 o la SEC ID Nº 11 o la SEC ID Nº 12 o un polipéptido aislado que comprende la secuencia de SEC ID Nº 3 o la SEC ID Nº 5 o la SEC ID Nº 7 o la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9. En una realización relacionada, la invención proporciona polipéptidos aislados, en la que los polipéptidos tienen la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID Nº 3, 5 o 7-10 y hasta 50 aminoácidos adicionales, preferentemente hasta 25 aminoácidos adicionales, más preferentemente hasta 15 aminoácidos adicionales, lo preferentemente hasta 10 aminoácidos adicionales, en la que los aminoácidos adicionales se localizan en el extremo amino o carboxilo o en ambos extremos. Los polipéptidos resultantes, fabricados de acuerdo con la invención, incluyen polipéptidos con una longitud total de menos de 50 aminoácidos. En una realización adicional relacionada, la invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado seleccionado de los aminoácidos 17-153 de SEC ID Nº 10, en el que el polipéptido consiste en las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9, o en el que el polipéptido consiste en fragmentos, variantes o análogos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % con las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9, o en el que el polipéptido consiste en las SEC ID Nº 8 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo carboxilo de la SEC ID Nº 8, o consiste en la SEC ID Nº 9 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo amino o en el extremo carboxilo o en ambos extremos de la SEC ID Nº 9, en el que el polipéptido aislado tiene actividad sensibilizante a la terapéutica para el cáncer.

2. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9 que están modificados mediante acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y/o ubiquitinación.

3. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 o 2.

4. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 3 seleccionado de uno o más de las siguientes: SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, o en el que el polinucleótido consiste en fragmentos, variantes o análogos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % con las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, en el que los fragmentos, variantes o análogos conservan la actividad sensibilizante a la terapéutica para el cáncer cuando se expresa.

5. Una composición que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 4, la SEC ID Nº 6, la SEC ID Nº 11 o la SEC ID Nº 12, un polipéptido aislado se seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9 o un polipéptido aislado, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 3 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo carboxilo de la SEC ID Nº 3, la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 5 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo amino de la SEC ID Nº 5, la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 8 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo carboxilo de la SEC ID Nº 8 o la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 9 y hasta 50 aminoácidos adicionales localizados en el extremo amino o en el extremo carboxilo o en ambos extremos de la SEC ID Nº 9.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 5.

7. Una composición que comprende dos o más de los polipéptidos de la reivindicación 5 o 6 y/o dos o más de los polinucleótidos de la reivindicación 5 o 6.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que además comprende un agente terapéutico contra el cáncer.

9. La composición de la reivindicación 7, que comprende al menos uno de los polipéptidos de la reivindicación 5 y al menos uno de los polinucleótidos de las reivindicaciones 4 o 7.

10, La composición de la reivindicación 8, en la que el agente terapéutico para el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en uno o más agentes quimioterapéuticos, uno o más agentes radioterapéuticos, uno o más agentes terapéuticos alternativos y combinaciones de los mismos.

11. Un polipéptido aislado para su uso en el tratamiento del cáncer, en el que el uso comprende:

(a) suministar el polipéptido aislado seleccionado de una o más de las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 y la SEC ID Nº 9 a una célula; y

(b) administrar un agente terapéutico contra el cáncer a la célula.

12. El polipéptido aislado de la reivindicación 11, en el que el suministro y la administración son simultáneas, el suministro precede al tratamiento o la administración precede al suministro.

13. El polipéptido aislado de la reivindicación 11, en el que el uso comprende:

(a) liberar un vector que comprende un polinucleótido seleccionado de una o más de las SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 4, la SEC ID Nº 11 y la SEC ID Nª 12; a una célula;

(b) expresar la secuencia portada por el vector, y

(c) administrar un agente terapéutico contra el cáncer a la célula.

14. El polipéptido aislado de la reivindicación 11 o 12, en el que el agente terapéutico para el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en uno o más agentes quimioterapéuticos, uno o más agentes radioterapéuticos, uno o más agentes terapéuticos alternativos y combinaciones de los mismos.

15. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el polipéptido comprende las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9.

16. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el polinucleótido comprende las SEC ID Nº 2, la SEC ID Nº 4, la SEC ID Nº 11 o la SEC ID Nº 12.

17. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la célula es una célula cancerosa resistente a un régimen terapéutico.

18. Un vector que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, y fragmentos, variantes o análogos de los mismos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % con las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, en el que los fragmentos, variantes o análogos de los mismos conservan la actividad sensibilizante a la terapéutica para el cáncer cuando se expresa.

19. El vector de la reivindicación 18, en el que el polinucleótido aislado está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

20, El vector de las reivindicaciones 18 o 19, en el que el vector es adecuado para terapia génica.

21. Una célula que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4, en la que el nucleótido está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

22. Una célula transfectada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

23. Una célula operable para expresar los polipéptidos de la reivindicación 1.

24. Un procedimiento ex vivo o in vitro de expresión de un polipéptido, que comprende:

(a) proporcionar un vector de expresión que codifica el polipéptido, en el que el polipéptido está seleccionado de una

o más de las siguientes: SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9, o en el que el polipéptido consiste en fragmentos, variantes o análogos con una identidad de secuencia de al menos un 90 % con las SEC ID Nº 3, la SEC ID Nº 5, la SEC ID Nº 8 o la SEC ID Nº 9, en el que los fragmentos, variantes o análogos conservan la actividad sensibilizante a la terapéutica para el cáncer.

(b) introducir el vector en una célula; y

(c) mantener la célula en condiciones que permitan la expresión.