CAPAS PROTEICAS Y SU USO EN MICROSCOPIA ELECTRÓNICA.

La presente invención se refiere a capas proteicas que se repiten con regularidad en dos dimensiones. En un aspecto, las capas proteicas se basan en ensamblajes de oligómeros simétricos capaces de autoensamblarse a partir de los monómeros del ensamblaje de oligómeros. Las capas pueden tener poros con dimensiones del orden de nanómetros a cientos de nanómetros. Las capas proteicas son nanoestructuras que tienen muchos posibles usos, por ejemplo como matriz para soporte de entidades moleculares para microscopia electrónica o cristalografía de rayos X. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de capas proteicas para realizar microscopia electrónica. El documento WO-00/68248 divulga estructuras proteicas regulares basadas en ensamblajes de oligómeros simétricos capaces de autoensamblarse. En concreto, el documento WO-00/68248 divulga estructuras formadas a partir de protómeros proteicos (denominados proteína de fusión en el documento WO-00/68248), que comprende al menos dos monómeros (denominados dominios de oligomerización en el documento WO-00/68248), que son, cada uno, monómeros de un correspondiente ensamblaje de oligómero simétrico. El autoensamblaje de los monómeros en el ensamblaje oligomérico produce el ensamblaje de las propias estructuras regulares. Se divulgan varios tipos de estructuras, incluidas estructuras pequeñas y estructuras que se extienden en una, dos y tres dimensiones. En el documento WO-00/68248, las orientaciones relativas de los monómeros dentro de los protómeros se seleccionan de modo que proporcionen la estructura regular deseada tras el autoensamblaje. Los monómeros se condensan a través de un rígido grupo de enlace que se selecciona cuidadosamente de modo que proporcione la orientación relativa necesaria de los monómeros en el protómero. Por ejemplo, en la producción del laboratorio publicada en el documento WO-00/68248, se realizó la selección del protómero usando un programa informático para modelar los monómeros conectados por un grupo de enlace en forma de un segmento de alfa-hélice intermedio continuo sobre un intervalo de longitudes que aumentan de forma creciente. Por tanto, por ejemplo, las matrices sugeridas en el documento WO-00/68248 que tienen una estructura regular que se repite en tres dimensiones se forman a partir de protómeros que comprenden dos monómeros de los respectivos ensamblajes oligoméricos diméricos o triméricos que son simétricos alrededor de un único eje de rotación. La orientación relativa de los dos monómeros se selecciona de modo que proporciona un ángulo específico de intersección entre el eje de simetría de rotación de los dos ensamblajes oligoméricos. Por tanto, hay una única fusión entre los dos ensamblajes oligoméricos y la orientación relativa de los ensamblajes oligoméricos está controlada mediante una cuidadosa selección del grupo de enlace que proporciona la fusión. El documento WO-00/68248 sólo publica la producción de laboratorio de estructuras proteicas de una pequeña jaula y un filamento que se extiende en una dimensión. Cabe esperar que la aplicación de las enseñanzas del documento WO-00/68248 a las capas proteicas que se repiten en dos dimensiones se encontrara con las dificultades siguientes. En primer lugar, cabe esperar que haya una dificultad en el diseño debido al requisito de seleccionar la orientación relativa de los monómeros dentro del protómero adecuado para construir una capa. Esto probablemente reduciría el número de tipos de ensamblaje oligomérico disponible para formar una capa proteica y, por tanto, dificultaría la identificación de proteínas adecuadas. En segundo lugar, cabe esperar que durante el ensamblaje se encuentren dificultades prácticas. Las estructuras divulgadas en el documento WO-00/68248 dependen de la rigidez de la fusión entre monómeros en los protómeros que forma la fusión sencilla entre ensamblajes oligoméricos. El documento WO-00/68248 enseña que la orientación relativa de los monómeros en los protómeros controla la orientación relativa de los ensamblajes oligoméricos en la estructura resultante, por tanto cabe esperar que la flexión de la fusión lejos de la orientación relativa deseada reduzca la fiabilidad del autoensamblaje. Cabe esperar que dicho problema sea más agudo a medida que el tamaño de la unidad de repetición aumenta, de modo que se proporciona una restricción práctica en la producción fiable de matrices con un tamaño de poro relativamente grande. Sería deseable proporcionar capas proteicas que tengan un tipo diferente de estructura en la que estos problemas previstos se podrían aliviar. Se ha apreciado que un uso particularmente ventajoso de una capa proteica que se repite con regularidad en dos dimensiones es realizar microscopia electrónica de una entidad molecular. Por tanto, de acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento de realizar microscopia electrónica de una entidad molecular, que comprende: proporcionar una capa proteica que tiene una estructura que se repite con regularidad en dos dimensiones y que soporta entidades moleculares cada una fijada en una posición predeterminada en la estructura de repetición de la capa proteica; y realizar microscopia electrónica de la capa proteica como soporte de las entidades moleculares para obtener una imagen Por tanto, la capa proteica actúa como soporte de entidades moleculares. Como las entidades moleculares, cada una en una posición predeterminada en la estructura de repetición de la capa proteica, las entidades moleculares son soportadas en una matriz regular. Esto proporciona ventajas significativas en la microscopia electrónica porque 2   permite la obtención de imágenes de un gran número de las entidades moleculares individuales en posiciones conocidas. Esto facilita varias formas de análisis de datos de la imagen derivada, de modo que se permite la investigación de la estructura de la entidad molecular. El procedimiento se puede aplicar a cualquier capa proteica que se repite con regularidad en dos dimensiones, pero tiene aplicación concreta a una capa proteica que se repite regularmente en dos dimensiones, comprendiendo la capa proteica protómeros de proteínas cada uno de los cuales comprende al menos dos monómeros condensados genéticamente, siendo cada uno de los monómeros monómeros de un respectivo ensamblaje oligomérico, en los que los protómeros comprenden: Un primer monómero que es un monómero de un primer ensamblaje oligomérico que pertenece a un grupo puntual diédrico del orden O, donde O es igual a 3, 4 o 6, y que tiene un grupo de ejes de simetría rotacional O de orden 2 que se extiende en dos dimensiones; y un segundo monómero condensado genéticamente a dicho primer monómero en el que el segundo monómero es un monómero de un segundo ensamblaje oligomérico que tiene un eje de simetría rotacional de orden 2, los primeros monómeros de los protómeros están ensamblados en dicho primer ensamblaje oligomérico y los segundos monómeros de los protómeros están ensamblados en dichos segundos ensamblajes oligoméricos, estando dicho eje de simetría rotacional de dichos segundos ensamblajes oligoméricos de orden 2 alineado con uno de dicho grupo de ejes de simetría rotacional del orden 2 de uno de dichos primeros ensamblajes oligoméricos con dos protómeros dispuestos simétricos a su alrededor. Como resultado del uso de un segundo ensamblaje oligomérico que tiene un eje de simetría rotacional del mismo orden 2 como el grupo de O ejes de simetría rotacional de dicho primer ensamblaje oligomérico, los ensamblajes oligoméricos se condensan con los ejes de simetría alineados y con 2 protómeros dispuestos simétricamente alrededor. Esto significa que hay una fusión por dos entre el primero y el segundo ensamblaje oligomérico. Además, el patrón de repetición de la capa proteica deriva de la disposición de los ejes de simetría rotacional del primer ensamblaje oligomérico y no depende de la orientación relativa de los monómeros dentro del protómero. Como el primer ensamblaje oligomérico es diédrico, el grupo de O ejes de simetría de orden 2 son coplanares. Por tanto, los protómeros se ensamblan en una capa que tiene la misma simetría que el grupo de O ejes de simetría. Por tanto, dichas capas proteicas se pueden diseñar seleccionando ensamblajes de oligómeros con una simetría adecuada para construir una capa que se repita en dos dimensiones. Los protómeros se producen de modo que comprendan monómeros de los ensamblajes de oligómeros seleccionados condensados entre sí. Posteriormente, se deja que los protómeros se autoensamblen en condiciones adecuadas. Para ayudar a la comprensión, se hace referencia a la Figura 1, que ilustra un ejemplo concreto de dicha capa proteica 1. La Figura 1 sólo muestra una parte de la capa proteica 1 que se repite de forma indefinida... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de realizar microscopia electrónica de una entidad molecular, que comprende: proporcionar una capa proteica que tiene una estructura que se repite con regularidad en dos dimensiones y que soporta entidades moleculares cada una fijada en una posición predeterminada en la estructura de repetición de la capa proteica; y realizar microscopia electrónica de la capa proteica como soporte de las entidades moleculares para obtener una imagen. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha etapa de proporcionar una capa proteica que soporta entidades moleculares cada una fijada en una posición predeterminada en la estructura de repetición de la capa proteica; y realizar microscopia electrónica de la capa proteica como soporte de las entidades moleculares para derivar una imagen. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que además comprende, antes de la etapa de realizar microscopia electrónica, alinear las entidades moleculares con respecto a la matriz proteica. 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa de alinear las entidades moleculares con respecto a la matriz proteica comprende aplicar un campo eléctrico a la matriz proteica o enfriar la matriz proteica hasta un estado de energía mínima. 5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende realizar un análisis de datos cristalográfico en dos dimensiones de una imagen. 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el análisis de datos comprende identificar los componentes de la matriz proteica y restarlos de la imagen derivada en dicha etapa de realizar microscopia electrónica para derivar una imagen de las entidades moleculares y realizar una reconstrucción de partícula única de la imagen de las entidades moleculares. 7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la capa proteica es una capa proteica que se repite con regularidad en dos dimensiones, comprendiendo la capa proteica protómeros cada uno de los cuales comprende al menos dos monómeros condensados genéticamente, siendo cada uno de los monómeros monómeros de un respectivo ensamblaje oligomérico, en los que los protómeros comprenden: un primer monómero que es un monómero de un primer ensamblaje oligomérico perteneciente a un grupo puntual poliédrico de orden O, en el que O es igual a 3, 4 o 6, y que tiene un grupo de O ejes de simetría rotacional de orden 2 que se extiende en dos dimensiones; y un segundo monómero genéticamente condensado con dicho primer monómero, en el que el segundo monómero es un monómero de un segundo ensamblaje oligomérico que tiene un eje de simetría rotacional de orden 2, los primeros monómeros de los protómeros se ensamblan en dichos primeros ensamblajes oligoméricos y los segundos monómeros de los protómeros están ensamblados en dichos segundos ensamblajes oligoméricos, estando dicho eje de simetría rotacional de dichos segundos ensamblajes oligoméricos de orden 2 alineado con uno de dicho grupo de ejes de simetría rotacional de orden 2 de uno de dichos primeros ensamblajes oligoméricos con dos protómeros dispuestos simétricamente alrededor. 8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el segundo ensamblaje oligomérico pertenece a un grupo puntual diédrico de orden 2 o a un grupo puntual cíclico de orden 2. 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que los protómeros son homólogos o heterólogos con respecto a los monómeros. 10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los protómeros son homólogos con respecto a los monómeros y el segundo ensamblaje oligomérico es un ensamblaje oligomérico heterólogo de dichos segundos monómeros y de terceros monómeros, comprendiendo además dicha capa proteica dichos terceros monómeros ensamblados con dichos segundos monómeros en dicho segundo ensamblaje oligomérico. 11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los terceros monómeros son monómeros que tienen un sitio de unión capaz de unir la biotina o un péptido, y dichos segundos monómeros son aptámeros que son capaces de unirse a dicho sitio de unión. 12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichos terceros monómeros son estreptavidina y/o dichos segundos monómeros son Streptag I (SEC ID Nº 3). 13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los protómeros son heterólogos con respecto a los monómeros y la capa proteica comprende protómeros proteicos de dos tipos, 27   comprendiendo el primer tipo de protómero un primer monómero que es un monómero de dicho primer ensamblaje oligomérico que pertenece a un grupo puntual diédrico de orden 0, en el que O es igual a 3, 4 o 6, condensado genéticamente con un segundo monómero que es un monómero de dicho segundo ensamblaje oligomérico, siendo dicho segundo ensamblaje oligomérico un ensamblaje oligomérico heterólogo perteneciente a un grupo puntual cíclico de orden 2, y comprendiendo el segundo tipo de protómero un tercer monómero que es un monómero de dicho segundo ensamblaje oligomérico genéticamente condensado con un cuarto monómero que es un monómero de un tercer ensamblaje oligomérico, perteneciendo dicho tercer ensamblaje oligomérico a un grupo puntual diédrico de orden 2 o O. 14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicho tercer ensamblaje oligomérico pertenece a un grupo puntual diédrico de orden O, siendo dicho tercer ensamblaje oligomérico el mismo que dicho primer ensamblaje oligomérico. 15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las entidades moleculares están fijadas por medio de uno de: siendo un componente de la capa proteica un marcador de afinidad, estando las entidades moleculares fijadas a los respectivos marcadores de afinidad; comprendiendo la entidad molecular una proteína que tiene un marcador de afinidad peptídico fijado a un componente de la capa proteica; comprendiendo la entidad molecular una proteína y tanto un componente de la capa proteica y la entidad molecular tienen marcadores de afinidad respectivos fijados; o estando las entidades moleculares condensadas genéticamente dentro de un componente de la capa proteica. 28   29     31