Un procedimiento para separar un complejo que comprende las siguientes etapas:

(1) una etapa de disponer (a) una disolución que contiene un analito o un análogo del mismo y (b) una disolución que contiene no menos de un tipo de una sustancia capaz de formar el complejo con dicho analito o dicho análogo del mismo (la sustancia formadora de complejos), como cada zona separada en un capilar, de manera que al aplicar un voltaje a dicho capilar se forma el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos, en el que entre dichas disoluciones, una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más elevada se dispone corriente arriba de una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más baja;

(2) una etapa de poner en contacto dicho analito o dicho análogo del mismo con la sustancia formadora de complejos por medio de la utilización de las diferencias en la movilidad electroforética, concentrando al mismo tiempo dicho analito o dicho análogo del mismo y/o al menos un tipo de sustancia formadora de complejos electroforéticamente, juntando dicho analito o dicho análogo del mismo y/o dicha sustancia formadora de complejos tras la aplicación de un voltaje en un capilar al aplicar un voltaje a dicho capilar antes de mezclar uniformemente estas disoluciones para formar el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos; y

(3) una etapa de separar dicho complejo, y la sustancia formadora de complejos no involucrada en la formación de dicho complejo o el análogo no involucrado en la formación de dicho complejo por otro movimiento eléctrico

Procedimiento de formación de complejos y procedimiento de separación.

Antecedente de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento que comprende formar un complejo entre un analito o un análogo del mismo en una muestra, y una sustancia capaz de formar un complejo con dicho analito o su análogo (abreviado a continuación en el presente documento como sustancia formadora de complejo o SFC), un procedimiento para separar un complejo formado y una SFC o un análogo no involucrado en la formación de dicho complejo, junto con un procedimiento para medir un analito en una muestra, basándose en la cantidad de un complejo separado, o en la cantidad de una SFC o un análogo no involucrado en la formación de un complejo.

El análisis de un analito en una muestra usualmente requiere mezclar una pluralidad de disoluciones tales como una muestra y diversas disoluciones de reactivos (por ejemplo, una disolución de reactivos que incluye un anticuerpo contra un analito, una disolución de reactivos que contiene una sustancia marcadora), y someter un analito en una muestra y un reactivo en una disolución de reactivos (un anticuerpo contra un analito o una sustancia marcadora) a una reacción.

En el micro Sistema de Análisis Total (µ-TAS) que usa dispositivos de microfluídica, en el que recientemente se ha estado desarrollando su tecnología y sobre el que se han realizado diversas investigaciones, se ha descubierto un procedimiento para mezclar previamente esta pluralidad de disoluciones y para someterlas a una reacción fuera de un capilar (canal), introduciendo a continuación la disolución mezclada en un capilar (canal), o un procedimiento para introducir simultáneamente una pluralidad de disoluciones en un capilar mezclador (canal) para llevar a cabo la mezcla y la reacción (documento JP-A-2005-31070).

Sin embargo, en el procedimiento anterior, es necesaria una muestra o una disolución de reactivos en una cantidad del orden de microlitros (µl) para realizar la mezcla por adelantado, perdiendo así la ventaja del µ-TAS, a saber la posibilidad del microanálisis de una muestra o una disolución de reactivos en una cantidad del orden de nanolitros (nl) hasta picolitros (pl). Además, en el último procedimiento, el flujo laminar generado en un capilar tras la introducción hace difícil la mezcla de una pluralidad de disoluciones, dando como resultado la necesidad de depender de la difusión molecular, que plantea un problema tal como, en el caso de mezclar una pluralidad de disoluciones con diferente peso molecular o viscosidad, la variación del tiempo de mezcla completa de estas disoluciones por la variación del coeficiente de difusión, o la variación en la relación de la viscosidad de las disoluciones a mezclar varía la relación de volúmenes de una pluralidad de disoluciones a introducir en un canal, dando como resultado la variación de la relación de mezcla según los tipos de disoluciones a mezclar, que plantea el problema de hacer imposible la mezcla en una relación de mezcla constante.

Además, como procedimientos diferentes del anterior, existen procedimientos dados a conocer en Bao, J. M, Regnier, F. E, J. Chromatogr. 1992, 608, 217-224 o Documento JP-A-10-512371.

S. Kiessig y col. J. Chromatogr. A 1999, 853, 469-477 describen la evaluación de la formación de complejos entre ciclofilina y ciclosporina A o sus derivados (CsH y bCsA). En este enfoque, las características de la electroforesis capilar de afinidad (ACE) se combinaron con la técnica de microanálisis mediada electroforéticamente (EMMA).

El Documento US 5958202 da a conocer la determinación de analitos por medio de electroforesis capilar. En la misma, se forma un complejo entre un analito y un competidor que lleva un resto de biorreconocimiento fuera del capilar. Posteriormente, el aducto-analito-competidor se detecta por medio de una funcionalidad enzimática del competidor que al reaccionar con un sustrato en el dispositivo analítico consume o forma un producto detectable.

En estos procedimientos, en un capilar para análisis, se dispone una disolución que incluye una molécula con movilidad electroforética más elevada detrás de una disolución que contiene una molécula con movilidad electroforética más baja, de modo que una molécula con una movilidad electroforética más elevada alcanza a una molécula con movilidad electroforética más baja, por la aplicación de un campo eléctrico, por el que se lleva a cabo una reacción entre estas mismas moléculas. Estos procedimientos hacen posible la mezcla molecular de manera uniforme y en un tiempo corto comparado con los procedimientos de mezcla convencionales que dependen de la difusión molecular.

Sin embargo, estos procedimientos no son satisfactorios en eficacia de reacción y son necesarias contramedidas para asegurar suficiente eficacia de reacción para detectar un analito en una muestra con alta sensibilidad, por ejemplo, aumentar la concentración de moléculas a proporcionar a una reacción, o prolongar el tiempo de reacción retardando la velocidad de movimiento molecular por electroforesis.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento que comprende formar un complejo entre dicho analito o su análogo y dicha SFC en un tiempo corto y con alta eficacia de reacción, a un procedimiento para separar un complejo formado y a una SFC o su análogo no involucrado en la formación de dicho complejo de manera rápida, fácil y con un alto grado de precisión, junto con un procedimiento para medir un analito en una muestra con alta sensibilidad.

La presente invención está compuesta por el siguiente esquema:

(I) Un procedimiento para separar un complejo que comprende las siguientes etapas:

(1) una etapa de disponer (a) una disolución que contiene un analito o un análogo del mismo y (b) una disolución que contiene no menos de un tipo de una sustancia capaz de formar el complejo con dicho analito o dicho análogo del mismo (la sustancia formadora de complejos), como cada zona separada en un capilar, de manera que al aplicar un voltaje a dicho capilar se forma el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos, en el que entre dichas disoluciones, una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más elevada se dispone corriente arriba de una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más baja;

(2) una etapa de poner en contacto dicho analito o dicho análogo del mismo con la sustancia formadora de complejos por medio de la utilización de las diferencias en la movilidad electroforética, concentrando al mismo tiempo dicho analito o dicho análogo del mismo y/o al menos un tipo de sustancia formadora de complejos electroforéticamente, juntando dicho analito o dicho análogo del mismo y/o dicha sustancia formadora de complejos tras la aplicación de un voltaje en un capilar al aplicar un voltaje a dicho capilar antes de mezclar uniformemente estas disoluciones para formar el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos; y

(3) una etapa de separar dicho complejo y la sustancia formadora de complejos no involucrada en la formación de dicho complejo o el análogo no involucrado en la formación de dicho complejo por otro movimiento eléctrico.

(II) El procedimiento de la forma de realización (I) anterior para medir un analito que además comprende:

(4) una etapa de medir la cantidad del complejo separado de esa manera, o la cantidad de la sustancia formadora de complejos o el análogo no involucrado en la formación de dicho complejo para determinar la cantidad de dicho analito basándose en el resultado.

(III) El procedimiento de las formas de realización (I) o (II) anteriores, en el que la etapa (3) se lleva a cabo usando un principio de electroforesis diferente del usado en la etapa (2) y/o cambiando la intensidad de voltaje a aplicar, de la utilizada en la etapa (2).

(IV) El procedimiento de las formas de realización (I) o (II) anteriores, en el que la etapa (3) se lleva a cabo en una región de separación independiente de una parte donde se lleva a cabo la etapa (2) en dicho capilar.

(V) El procedimiento de las formas de realización (I) o (II) anteriores, en el que dicho analito o dicho análogo del...

1. Un procedimiento para separar un complejo que comprende las siguientes etapas:

(1) una etapa de disponer (a) una disolución que contiene un analito o un análogo del mismo y (b) una disolución que contiene no menos de un tipo de una sustancia capaz de formar el complejo con dicho analito o dicho análogo del mismo (la sustancia formadora de complejos), como cada zona separada en un capilar, de manera que al aplicar un voltaje a dicho capilar se forma el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos, en el que entre dichas disoluciones, una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más elevada se dispone corriente arriba de una disolución que contiene una sustancia con movilidad electroforética más baja;

(2) una etapa de poner en contacto dicho analito o dicho análogo del mismo con la sustancia formadora de complejos por medio de la utilización de las diferencias en la movilidad electroforética, concentrando al mismo tiempo dicho analito o dicho análogo del mismo y/o al menos un tipo de sustancia formadora de complejos electroforéticamente, juntando dicho analito o dicho análogo del mismo y/o dicha sustancia formadora de complejos tras la aplicación de un voltaje en un capilar al aplicar un voltaje a dicho capilar antes de mezclar uniformemente estas disoluciones para formar el complejo entre dicho analito o dicho análogo del mismo y la sustancia formadora de complejos; y

(3) una etapa de separar dicho complejo, y la sustancia formadora de complejos no involucrada en la formación de dicho complejo o el análogo no involucrado en la formación de dicho complejo por otro movimiento eléctrico.

2. Un procedimiento de la reivindicación 1 para medir un analito que además comprende

(4) una etapa de medir la cantidad del complejo separado de esa manera, o la cantidad de la sustancia formadora de complejos o el análogo no involucrado en la formación de dicho complejo para determinar la cantidad de dicho analito basándose en el resultado.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (3) se lleva a cabo usando un principio de electroforesis diferente del usado en la etapa (2) y/o cambiando la intensidad de voltaje a aplicar, de la utilizada en la etapa (2).

4. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (3) se lleva a cabo en una región de separación independiente de una parte donde se lleva a cabo la etapa (2) en dicho capilar.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho analito o dicho análogo del mismo y/o al menos un tipo de sustancia formadora de complejos se concentran no menos de 1,5 veces como resultado de la aplicación del voltaje en la etapa (2).

6. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (2) se lleva a cabo por ITP (isotacoforesis) o FASS (apilación de muestras con amplificación de campo).

7. El procedimiento de la reivindicación 6, se en el que la etapa (3) se lleva a cabo por CGE (procedimiento de electroforesis capilar en gel).

8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que no menos de un tipo de sustancia formadora de complejos está unido con una sustancia marcadora y/o una sustancia capaz de cambiar la movilidad electroforética de dicho analito o dicho análogo del mismo.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho análogo es uno unido con una sustancia marcadora o una sustancia capaz de cambiar la movilidad electroforética de dicho analito o dicho análogo del mismo.

10. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que se usan no menos de dos tipos de sustancias formadoras de complejos, y se usan no menos de dos tipos de disoluciones que contienen cada una de tales sustancias formadoras de complejos, y (1) al menos un tipo de las sustancias formadoras de complejos es uno unido con una sustancia marcadora, y al menos un tipo de otra sustancia formadora de complejos es uno unido con una sustancia capaz de cambiar la movilidad electroforética de dicho analito o dicho análogo del mismo, o (2) al menos un tipo de las sustancias formadoras de complejos es uno unido con una sustancia marcadora y una sustancia capaz de cambiar la movilidad electroforética de dicho analito o dicho análogo del mismo.

11. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que un tipo de las sustancias formadoras de complejos es un anticuerpo para dicho analito o dicho análogo del mismo, o una proteína que se une a dicho analito o dicho análogo del mismo.