Electroforesis con inmunodesplazamiento.

Método para el análisis de una muestra que puede comprender un compuesto objetivo o un grupo de compuestos objetivos,

el método que comprende

- mezclar al menos una porción de la muestra con una pareja de unión para el compuesto objetivo o un grupo de compuestos objetivo, la pareja de unión siendo una macromolécula que comprende (i) un segmento capaz de unirse específicamente al compuesto objetivo y (ii) un segmento de polímero polianiónico; y

- separar la muestra que contiene la pareja de unión por electroforesis en un canal que comprende un medio de separación en el que la pareja de unión tiene una carga neta negativa.

Electroforesis con inmunodesplazamiento

La invención se refiere a un método para el análisis de una muestra por electroforesis, haciendo uso de una pareja de unión para un compuesto objetivo o grupo de compuestos objetivo que se puede presentar en la muestra. La electroforesis ha sido un método bien establecido para el análisis de varias muestras, que incluyen muestras que comprenden compuestos biológicos tal como proteínas, durante muchas décadas.

A través de los años se han desarrollado métodos bien establecidos. Por ejemplo, la separación de proteínas séricas en una serie de bandas características mediante electroforesis, se refieren comúnmente como gamma, beta, alfa-1 y 2 y albúmina es bien conocida por aquellos con experiencia en la materia y se describe bien en una amplia variedad de materiales de referencia, tal como el manual 'Protein Electrophoresis in Clinical Diagnosis' por David F. Keren, 2003, Publicaciones Arnold.

Los métodos comúnmente conocidos incluyen el uso de técnicas en donde un compuesto específico se somete a una formación de complejos con una pareja de unión específica, tal como un anticuerpo contra ese compuesto. Tales técnicas se pueden usar para eliminar el compuesto de la muestra antes de la separación electroforética (típicamente referida como ¡nmunosustracción cuando un anticuerpo se usa como una pareja de unión) o para modificar la movilidad electroforética eficaz de ese compuesto durante la electroforesis (referido como ¡mmunodesplazamiento cuando un anticuerpo se usa como una pareja de unión).

El compuesto objetivo que forma un complejo con la pareja de unión puede ser un compuesto que debe ser identificado, por ejemplo, una inmunoglobulina monoclonal que puede ser un indicador de una gammapatía monoclonal. En los ejemplos donde la pareja de unión es un anticuerpo este método se puede referir como ¡mmunotipificación.

Alternativamente, el compuesto objetivo puede ser un factor de interferencia, es decir, que altera potencialmente el análisis de una muestra por otro compuesto cuya presencia debe determinarse, mediante, por ejemplo, la co-migración con el analito de Interés o en otro sentido enmascara su presencia, por ejemplo una gammaglobulina que puede migrar muy cerca de ¡soformas de transferrlna deficientes en carbohidratos e impedir así su uso como un marcador de diagnóstico para el consumo excesivo de alcohol.

La electroforesis capilar es una forma específica de electroforesis, en donde un capilar se usa para realizar la electroforesis. La electroforesis capilar ofrece ventajas tales como tiempos de análisis cortos y una alta resolución. Un método para el análisis electroforético capilar de una muestra que comprende un compuesto cuya presencia se debe determinar (es decir, analito), en donde se hace uso de un anticuerpo como una pareja de unión para el analito se describe en WO 95/20160. El método implica

(a) separar una primera porción de la muestra en partes de analito constituyentes mediante electroforesis capilar, y detectar dichas partes;

(b) mezclar una segunda porción de dicha muestra con al menos una pareja de unión específica con un analito candidato predeterminado, dicha pareja de unión específica tiene una movilidad electroforética diferente de la de dicho analito candidato, confiriéndole por lo tanto, a los complejos resultantes formados una movilidad electroforética diferente a la del analito no unido;

(c) separar dicha segunda porción en partes constituyentes mediante electroforesis capilar, y detectar dichas partes; y,

(d) comparar las partes constituyentes separadas de la etapa (c) con las partes constituyentes separadas de la etapa (a).

Como una pareja de unión específica se usa preferentemente un anticuerpo que se ha modificado químicamente con un anhídrido, tal como anhídrido succínico, para proporcionar el anticuerpo con funciones de ácido carboxílico adicionales, negativas a pH alcalino. En las condiciones analíticas descritas en el ejemplo (pH 10) la carga negativa global del anticuerpo modificado se aumenta por lo tanto, en comparación con el anticuerpo sin modificar. Sin embargo, como se muestra en la Figura 1 de W095/20160, el anticuerpo modificado todavía migra estrechamente a la inmunoglobulina humana (IgG) y, particularmente el complejo del anticuerpo modificado con IgG no se separa completamente de IgG no complejado. Es evidente que en una muestra biológica real, que se debe analizar para el presencia de una o más proteínas séricas (por ejemplo, suero sanguíneo, orina, líquido cefalorraquídeo), la migración electroforética del anticuerpo modificado y, particularmente del complejo de anticuerpo e inmunoglobulina en la muestra puede ser tal que pueden co-migrar con las proteínas séricas, por ejemplo, otra inmunoglobulina, una transferrina, albúmina o bis- albúmlna, para la cual se debe analizar la muestra.

US 2005/0164302 A1 propone un método alternativo para separar los constituyentes de una muestra biológica y llevar a cabo el inmunodesplazamiento para permitir la tipificación de proteínas monoclonales que se pueden presentar en la muestra biológica analizada. Se menciona que el método permite el desplazamiento fuera de la zona correspondiente al perfil de la migración de las proteínas de la muestra, particularmente, fuera de la zona de migración de la globulina. Se dice que se lleva a cabo mediante la modificación de la pareja de unión (un anticuerpo) de una manera específica. Las

modificaciones específicas mostradas son una modificación de los anticuerpos con anhídrido tricarboxílico y la modificación con ácido melítico. A partir de los ejemplos se evidencia que el anticuerpo modificado tiene un efecto en que se lleve a cabo el inmunodesplazamiento, pero es evidente también que el anticuerpo o complejo de anticuerpo modificado e inmunoglobulina de la muestra no se separa totalmente de otras proteínas en la muestra. Notablemente, varios electroferogramas, por ejemplo, Figuras 2e, 4b, 5a, 9a y 9b de US 2005/0164302 A1, sugieren una superposición con albúmina y posiblemente otras proteínas que migran entre la albúmina y las inmunoglobulinas de la muestra. Más aun, en una prueba realizada por los presentes inventores el tiempo de migración de un anticuerpo (IgG) sin modificar y un anticuerpo (IgG) modificado con anhídrido de ácido tricarboxílico benceno en un tampón a pH 10 (que comprende ácido 3-ciclohexilamino-1-propanosulfónico (CAPS) y ácido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS)), se encontró que el anticuerpo modificado tuvo un tiempo de migración (tiempo máximo parte superior) que fue similar al tiempo de migración de la albúmina, lo que indica que el anticuerpo modificado no se puede separar de los valores iniciales de la albúmina en una muestra de suero sanguíneo. Más aun, esto indica de que un complejo del anticuerpo modificado y una inmunoglobulina en una muestra de suero pueden tener un tiempo de migración entre el tiempo de migración de inmunoglobulinas y el tiempo de migración de la albúmina. Así, el complejo puede probablemente al menos de forma parcial co-migrar con otras proteínas, por ejemplo, las proteínas del suero banda-alfa, en un análisis electroforético usando un tampón de ese tipo. Así, sigue siendo un reto para evitar la co-migración del complejo no- deseada, especialmente en la separación de una muestra complicada, tal como un suero sanguíneo u otra muestra biológica.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un método novedoso para analizar una muestra, particularmente, una muestra de un fluido corporal que puede comprender una o más proteínas séricas, para la presencia de uno o más compuestos de interés, tales como una o más proteínas séricas, haciendo uso de una pareja de unión, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, que es capaz de unirse a un compuesto objetivo específico, que puede ser un compuesto cuya presencia se debe determinar (un analito) o un compuesto que puede interferir con el análisis de la muestra.

Particularmente, es un objetivo de la invención proporcionar un método que permite la separación de la línea base de la pareja de unión, y preferentemente de un complejo de la pareja de unión y el compuesto objetivo, a partir de cualquier componente de la muestra, o al menos de cualquier proteína cuya presencia se debe determinar.

Uno o más objetivos adicionales que pueden encontrarse de acuerdo con la invención se harán evidentes a partir de la

descripción y/o reivindicaciones.

Los inventores encontraron que es posible usar una pareja de unión que se ha modificado de una manera específica en un método de análisis electroforético.

Como consecuencia, la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Método para el análisis de una muestra que puede comprender un compuesto objetivo o un grupo de compuestos objetivos, el método que comprende

- mezclar al menos una porción de la muestra con una pareja de unión para el compuesto objetivo o un grupo de compuestos objetivo, la pareja de unión siendo una macromolécula que comprende (i) un segmento capaz de unirse específicamente al compuesto objetivo y (ii) un segmento de polímero polianiónico; y

- separar la muestra que contiene la pareja de unión por electroforesis en un canal que comprende un medio de separación en el que la pareja de unión tiene una carga neta negativa.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto objetivo o grupo de compuestos objetivo se selecciona a partir del grupo de las proteínas séricas, particularmente del grupo de ¡nmunoglobulinas, macroglobulinas y microglobulinas séricas.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el segmento polianiónico se selecciona a partir del grupo de poli(aminoácidos) polianiónicos, polijácidos carboxílicos), poli(ácidos sulfónicos), polinucleótidos, polisacárldos carboxilados, polisacáridos sulfatados y polisacáridos fosforilados incluyendo copolímeros de los mismos.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el segmento polianiónico se selecciona a partir del

grupo de pollllsinas de las cuales el 90-100 % de los grupos laterales de amina se transformaron en grupos

laterales aniónicos, poliargininas de las cuales el 90-100 % de los grupos laterales de amina se transformaron en grupos laterales aniónicos, polihistidiñas de las cuales el 90-100 % de los grupos laterales de amina se transformaron en grupos laterales aniónicos, poliasparaginas, de las cuales el 90-100 % de los grupos laterales de amina se transformaron en grupos laterales aniónicos, poliglutaminas de las cuales el 90-100 % de los grupos laterales de amina se transformaron en grupos laterales aniónicos, ácidos poliglutámicos, ácidos pollaspártlcos, carboxialquilcelulosas, heparlnas, dextranos sulfatados, ácidos hialurónicos, ácidos pollsulfónlcos, ácidos polimaleicos y ácidos poliacríllcos, Incluyendo copolímeros de los mismos.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el segmento polianiónico se selecciona a partir del

grupo de polilisinas de la cual el 90-100 % de los grupos laterales de amina se modificaron con un ácido

policarboxílico o anhídrido del mismo.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el segmento de polímero polianiónico tiene un peso molecular promedio numérico de al menos 20 kD.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el segmento de polímero polianiónico tiene un peso molecular promedio numérico de al menos 40 kD.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el segmento de polímero polianiónico tiene un peso molecular promedio numérico de al menos 50 kD.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el segmento capaz de unirse específicamente al compuesto objetivo es un anticuerpo, que tiene especificidad antigénica para el compuesto objetivo.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la separación de la muestra se lleva a cabo usando un tampón que tiene un pH en el intervalo de pH 8.0 a 11.0.

11. Método según la reivindicación 10, donde la separación de la muestra se llevó a cabo utilizando un tampón que tiene un pH en el Intervalo de pH 9.0 a 10.7.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la separación de la muestra se lleva a cabo usando un tampón que tiene un pH en el intervalo de 9.5 -10.5.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde además una porción de la muestra se analiza usando electroforesis sin mezclarse con la parte de unión de cualquier otra forma bajo las mismas condiciones, y comparar un resultado del análisis de dicha porción con un resultado del análisis de la porción que se analizó después de mezclar con la pareja de unión.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el análisis comprende la determinación cualitativa y/o cuantitativa de la presencia de un compuesto seleccionado a partir del grupo de las proteínas séricas, particularmente un compuesto seleccionado a partir del grupo de las ¡nmunoglobulinas, microglobulinas, macroglobulinas; transferrinas, que incluyen transferrinas deficientes de carbohidratos.