La invención comprende una técnica para el aislamiento y posterior identificación de proteínas pertenecientes a un complejo que permite una mejora en la eficacia de la identificación proteica.

Para su realización se requiere el empleo de un novedoso aparato de electroforesis que comprende una base soporte (1) en el interior de la cual se encuentra al menos una cubeta de refrigeración (2) que alberga hielo o cualquier elemento refrigerante y dentro de la misma al menos una subcubeta (3) que contiene agua, comprendiendo cada subcubeta (3) al menos una minicubeta (4) de transferencia en el interior de las subcubetas que comprende dos electrodos (5) conectables a la fuente de energía eléctrica, entre los cuales se disponen los sujetadores (6) del gel (9) que aseguran que el gel esté transversalmente posicionado con respecto a la dirección de transmisión de la corriente, lo que permite que las proteínas se desplacen transversalmente en el gel y abandonen el mismo

Procedimiento para la elución, separación e identificación de proteínas y aparato para realizarlo.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de los procedimientos que incluyen la electroforesis para la separación de proteínas y sus complejos y aparatos para realizarla.

Antecedentes de la invención

En la fisiología de tejidos y órganos, las proteínas de las células que los constituyen establecen interacciones específicas que son críticas para el correcto funcionamiento de estos. El estudio de las interacciones proteicas en el contexto celular se llama señalización celular y su comprensión es imprescindible para elucidar la base molecular de las patologías que afectan a tejidos y órganos tanto animales como vegetales. Con este objetivo se han adaptado métodos basados en técnicas electroforéticas. La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas que poseen grupos ionizables a través de una matriz porosa o gel, introducido en un gradiente electro-voltaico; la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el ánodo y si tiene carga negativa, hacia el cátodo. Las moléculas suelen ser ácidos nucleicos o proteínas. Los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran de manera natural hacia el cátodo. Las proteínas, sin embargo, pueden tener cargas positivas o negativas y su movilidad específica en un gel de electroforesis es menos predecible. Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO- y -NH3⁺) y pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente o bien permanecer eléctricamente neutras. Según sea la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En su punto isoeléctrico (pl), la proteína tiene carga neta cero. En función de pl, las proteínas presentan una relación carga/masa (z/m) específica que determina su movilidad a través del gel: por debajo del pl las proteínas estarán cargadas positivamente y por encima del pl, negativamente. Esta técnica se aplica en los campos de la bioquímica, la biología celular y la bíomedicina para la identificación de proteínas. Sin embargo, debido a que las proteínas sufren modificaciones post-translacclonales y asociaciones entre ellas, la electroforesis no es suficiente para su identificación.

Los anticuerpos son complejos proteicos que se caracterizan por su capacidad de unirse con extrema afinidad a proteínas o fragmentos de ellas dependiendo de su topología molecular. Un gran avance en el campo de la identificación de proteínas ha venido dado por el método de separación inmunológica de proteínas también conocido como inmunoprecipitación. Este método permite seleccionar una proteína específica de una solución de proteínas altamente concentrada proveniente de un tejido u órgano. Por ejemplo, la inmunoprecipitación permite aislar factores celulares, tales como aquellos que modulan la expresión genética. Para ello, un órgano, tejido o cultivo celular ha de ser homogeneízado y lisado de manera que se abran los compartimentos celulares y se viertan las proteínas en una solución tampón adecuada. El volumen de esta solución tampón es critico puesto que a ella se añadirán los anticuerpos, reactivos muy costosos y en ocasiones difíciles de obtener. Debido a la especificidad de los anticuerpos, una solución muy concentrada de proteínas varias no impide el aislamiento de la proteína en estudio. Al contrario, una concentración alta de proteínas favorece la afinidad de la unión. Por ello en ocasiones se añade albúmina o gelatina de pescado en la mezcla de reacción. El anticuerpo se añade al lisado celular donde se une específicamente a la proteína de interés y se rescata posteriormente mediante centrifugación, unido todavía a dicha proteína, con un segundo anticuerpo que está a su vez unido a partículas de agarosa. Una solución desnaturalizante (que contiene un detergente, generalmente SDS) libera las asociaciones entre proteínas lo cual permite su identificación mediante una electroforesis en gel seguida de un análisis por western blot. La técnica de western blot consiste en una transferencia de las proteínas de un gel de electroforesis, separadas en bandas según su relación z/m, a un soporte, generalmente de polivinilo, mediante una electroforesis horizontal. Tras la transferencia, el soporte, al cual se han adherido las proteínas, se incuba con una mezcla de albúmina o gelatina y anticuerpo específico. Así se pueden identificar las proteínas mediante su peso molecular (altura en el gel) y su unión específica al anticuerpo, que será detectado por un segundo anticuerpo unido a una molécula detectable (generalmente capaz de impresionar un film de radiografía). A menudo, la unión específica al anticuerpo no es suficiente para la identificación de la proteína puesto que aparecen bandas adicionales en el western blot. Esto tal vez sea debido a degradación de la proteína durante su manipulación o tal vez a que las proteínas adicionales se asocian en la fisiología normal de la proteína en estudio y por lo tanto, un anticuerpo policlonal es capaz de unirse a ellas. La identificación de tales proteínas es de gran importancia a la hora de comprender la fisiología de los tejidos. Sin embargo, un problema de esta técnica es que el lisado celular favorece asociaciones inespecíficas entre proteínas anteriormente separadas por compartimentos celulares; algunas de las proteínas que obtenemos en la centrifugación no deberían estar unidas al complejo proteína-anticuerpo. Como hemos dicho, en la fisiología normal de la célula se establecen asociaciones proteína-proteína que son de interés en el estudio de la señalización celular. En procesos patológicos dichas asociaciones son aberrantes, por ello urge encontrar un método de identificación de proteínas que garantice la especificidad de las asociaciones y pueda utilizarse para el estudio de las bases moleculares de las patologías. Algunos investigadores han intentado deshacerse de las asociaciones inespecíficas por medio de una electroforesis previa a la inmunoprecipitación. Las proteínas, organizadas en bandas según su relación z/m eluyen del gel de electroforesis de manera organizada permitiendo su selección. Sin embargo, hasta ahora no ha sido práctico realizar la separación inmunológica de proteínas mediante esta metodología puesto que el volumen de electroforesis es demasiado grande para permitir el uso de los anticuerpos (dado su alto coste y porque han de utilizarse a elevadas concentraciones de proteínas).

Los inventores de la presente invención han solucionado este antiguo problema mediante el diseño de un nuevo aparato de electroforesis que permite eluir la banda proteica de interés en un volumen pequeño, de manera que los anticuerpos pueden utilizarse efectivamente. Por lo tanto, este nuevo aparato supone una revolución en el campo del aislamiento, separación e identificación inmunológica de proteínas eliminando el problema de asociaciones proteicas inespecíficas al permitir una electroforesis previa a la inmunoprecipitación y la posterior identificación de las proteínas asociadas a los complejos de señalización celular.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención comprende, en un aspecto, un aparato de electroforesis que permite eluir proteínas contenidas en fragmentos seleccionados de un gel de electroforesis para su posterior análisis e identificación. El aparato comprende al menos dos minicubetas de transferencia. En dichas minicubetas se alojan 2 electrodos y los elementos de sujeción del gel de electroforesis que comprenden: los elementos de sujeción del gel, los clip fijadores y el elemento de sujeción integrada. Cada minicubeta, conteniendo sus correspondientes elementos de sujeción se aloja asimismo en una subcubeta de un tamaño superior al de la minicubeta de transferencia. Cada subcubeta está contenida en otra cubeta de refrigeración de mayor tamaño que a su vez se aloja en una base de soporte de la estructura.

Otro aspecto de la presente invención comprende un nuevo método para la elución y el aislamiento de proteínas contenidas en un gel de electroforesis. Este método comprende los pasos de: a) recorte del fragmento del gel que contiene las proteínas con el peso molecular de interés; b) Alojamiento del fragmento de gel recortado en el paso a) entre los soportes y ajuste de los elementos de sujeción c) Introducción del gel alojado en el paso b) en una minicubeta del aparato de electroforesis objeto de la presente invención, d) Rellenar la minicubeta del paso c)...

1. Aparato de electroforesis que comprende una base soporte en el interior de la cual se encuentra al menos una cubeta de refrigeración que alberga un elemento refrigerante como el hielo o similar y dentro de la misma al menos una subcubeta que contiene agua caracterizado porque comprende al menos una minicubeta (4) de transferencia en el interior de las subcubetas que comprende dos electrodos (5) conectables a la fuente de energía eléctrica, entre los cuales se disponen los sujetadores (6) del gel (9) que aseguran que el gel esté transversalmente posicionado con respecto a la dirección de transmisión de la corriente.

2. Aparato de electroforesis según la reivindicación 1 caracterizado porque la sujeción de los sujetadores se completa mediante fijadores (7, 8) que posicionan el conjunto de electrodos (5), sujetadores (6) y gel (9).

3. Aparato de electroforesis según la reivindicación 1 caracterizado porque cada subcubeta alberga al menos dos minicubetas (4) de transferencia.

4. Aparato de electroforesis según las reivindicaciones 1 y 3 caracterizado porque las minicubetas soportan variaciones de temperatura que oscilan entre la temperatura del agua refrigerada de las subcubetas y la temperatura producida en su interior por el paso de corriente entre los electrodos de la misma.

5. Aparato de electroforesis según la reivindicación 4 caracterizado porque el material de que está construidas las minicubetas es vidrio.

6. Aparato de electroforesis según la reivindicación 1 caracterizado porque los electrodos se construyen en una aleación de platino y niobio que proporcionan durabilidad y alta conductividad a los mismos.

7. Aparato de electroforesis según la reivindicación 1 caracterizado porque la intensidad de la corriente que atraviesa los electrodos (5) de cada minicubeta (4) es como máximo de 1 mA/cm², lo cual supone que el equipo trabaje con un voltaje de corriente aproximado de entre 3 y 10 V.

8. Método para la elución y el aislamiento de proteínas contenidas en un gel de electroforesis que comprende:

9. Método para la separación inmunológica de proteínas (inmunoprecipitación) que comprende:

10. Método para la identificación de proteínas de complejos proteicos que comprende: