Nueva proteína capaz de unirse al ácido hialurónico y procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la misma.

Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende unasecuencia de aminoácidos mostrada en la ID.

SEC. Nº: 2,

en el que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de lasecuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo deserina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en laposición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

Nueva proteína capaz de unirse al ácido hialurónico y procedimiento para medir el ácido hialurónico usando la misma Ámbito técnico La presente invención se refiere a una nueva proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico (proteína de unión al ácido hialurónico, en lo sucesivo, abreviada algunas veces como HABP) que es barata y superior en estabilidad de calidad, a un procedimiento para medir el ácido hialurónico con un elevado grado de precisión en la medida, y a un kit de reactivos que usa la misma.

Técnica antecedente El ácido hialurónico es un tipo de mucopolisacárido, y está contenido principalmente en el líquido sinovial y en el humor vítreo ocular de los animales, y en tejidos conectivos tales como el cordón umbilical y la dermis superior, y similares, de los animales. Se sabe que la concentración del mismo en sangre aumenta en los casos de enfermedad reumatoide, cáncer o enfermedad hepática, y por lo tanto se cree que el ácido hialurónico es útil para el diagnóstico de estas enfermedades, y hasta la fecha se han desarrollado varios procedimientos de medición.

Como procedimientos para medir el ácido hialurónico, se conoce un procedimiento en el que la medición se realiza mediante un ensayo de enzimoinmunoadsorción (ELISA) usando una HABP (Bibliografía Patente: 1, Literatura de Patente: 2, y similares) o un procedimiento de medición inmunológico que usa partículas de látex.

De entre ellos, se ha empleado ampliamente el procedimiento de medición inmunológico que usa partículas de látex debido a su simple procedimiento y aplicabilidad para dispositivos de mediciones múltiples. Como procedimiento de medición que usa partículas de látex como reactivo para medir el ácido hialurónico, se conoce un procedimiento que comprende procesos de soportar la HABP sobre partículas portadoras, hacer reaccionar la HABP con el ácido hialurónico de la muestra para formar un complejo de reacción, y determinar el ácido hialurónico mediante la detección del complejo de reacción (Literatura de Patente: 3) , y similares.

Por otro lado, como HABP se conocen proteoglucanos tales como el agrecano, y similares, proteínas conectoras y hialuronectina, y similares. De entre ellos, el agrecano es un proteoglucano de elevado peso molecular que supone aproximadamente el 90% del proteoglucano presente en el cartílago, contiene sulfato de condroitina, y está presente en el tejido cartilaginoso en una forma unida al ácido hialurónico. Además, el agrecano también se usa para la medición del ácido hialurónico.

Sin embargo, dado que el agrecano que se ha usado hasta ahora para la medición del ácido hialurónico es un producto purificado a partir de cartílago bovino, el agrecano tiene problemas tales como su fluctuación en la calidad interlote debido al producto natural y el elevado precio del mismo.

Por lo tanto, se ha deseado el desarrollo de una HABP que no tenga fluctuación en la calidad y que sea barata, y un procedimiento para obtener la HABP.

Lista de referencias Literatura de patente Literatura de Patente 1: JP-B-6-041952

Literatura de Patente 2: JP-B-2732718

Literatura de Patente 3: JP-B-3424504

Resumen de la invención Problema técnico En vista de la situación anterior, un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva HABP, un procedimiento para obtener una HABP sin ninguna fluctuación en su calidad así como a un precio barato, un procedimiento para medir el ácido hialurónico con un elevado grado de precisión en la medida, y un kit de reactivos que usa la misma.

Solución al problema La presente invención se creó con el fin de resolver los problemas descritos anteriormente, y se ha averiguado que puede obtenerse un ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos con una elevada homología con la secuencia de aminoácidos conocida del agrecano bovino, agrecano que es un tipo de HABP, a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir del ARNm de cartílago bovino. Además, los presentes inventores han averiguado que la HABP de la presente invención puede obtenerse transfectando la célula hospedadora con un vector de expresión recombinante que comprende el ADNc, y cultivando

la célula hospedadora para que exprese el ADNc.

Además, los presentes inventores han averiguado que llevando a cabo la medición del ácido hialurónico usando la HABP de la presente invención, puede realizarse una medición de elevada precisión del ácido hialurónico sin fluctuaciones en calidad e inhibiendo un fenómeno de prozona, en comparación con el procedimiento de medición del ácido hialurónico que usa el agrecano natural convencional.

A saber, la presente invención comprende las siguientes composiciones:

(1) Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en la que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácidos seleccionados de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

(2) Una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2; un residuo de aminoácido en la posición 130 a partir del Nterminal de la secuencia de aminoácidos es isoleucina; un residuo de aminoácido en la posición 131 es un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina.

(3) Un procedimiento para producir la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita en el anterior (2) , que comprende; cultivar una célula hospedadora transfectada por un Baculovirus integrado con un vector de expresión recombinante con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº:1, o un transformante obtenido transformando las células hospedadoras con el vector de expresión recombinante, y separar y purificar una proteína a partir del medio de cultivo.

(4) Un procedimiento para medir el ácido hialurónico, que comprende; poner en contacto el ácido hialurónico de una muestra con la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita anteriormente

(2) para formar un complejo del ácido hialurónico y la proteína, hacer reaccionar el complejo con un portador que soporta un anticuerpo específico para la proteína, medir un cambio óptico mediante un aglutinado obtenido a partir de la reacción, y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido.

(5) Un kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico, que comprende la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico descrita en el anterior (2) como un constituyente.

Efectos ventajosos de la invención La presente invención proporciona una nueva y barata HABP sin ninguna fluctuación entre los productos. Dado que la HABP de la presente invención es un producto recombinante, la HABP puede obtenerse a bajo coste y en grandes cantidades, y tiene una calidad superior y sin fluctuaciones en la calidad, en comparación con el agrecano natural.

Además, dado que la HABP de la presente invención tiene las características descritas anteriormente, usándola puede realizarse una medición barata y de elevada precisión del ácido hialurónico.

Breve descripción de los dibujos [Fig. 1] La Fig. 1 muestra los resultados de la electroforesis de la disolución de ARN total recuperada a partir del cartílago bovino del septo nasal en gel de agarosa al 1%, que se obtuvo en el Ejemplo 1 (1) . Además, las flechas de la Fig. 1 muestran las fracciones de ARNr 18s y ARNr 28s, respectivamente. [Fig. 2] La Fig. 2 muestra los resultados de la electroforesis del producto de la PCR en gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, que se obtiene en el Ejemplo 1 (3) . En la Fig. 2, el carril 1 muestra el resultado cuando se usó el marcador de peso molecular como muestra, y el carril 2 muestra el resultado cuando se usó un fragmento de producto de la PCR como muestra, respectivamente. Además, la flecha muestra una fracción del fragmento del producto de la PCR. [Fig. 3] La Fig. 3 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 (7) . En la Fig. 3, (a) se muestra el resultado de la tinción de plata del gel después de la SDS-PAGE, y (b)... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica para una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2, en el que la secuencia de aminoácidos tiene un residuo de isoleucina en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y un residuo de aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina en la posición 131 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos se muestra en la ID. SEC. Nº:

4.

3. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2 es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 1; una base en la posición 390 a partir del 5’ terminal del polinucleótido es la base seleccionada de entre T, C y A; y las bases en las posiciones 391 hasta 393 a partir del 5’ terminal son secuencias de nucleótidos seleccionadas de entre TAT, TAC, TCT, TCC, TCA, TCG, ACT, ACC, ACA, ACG, TGT, TGC, AAT, AAC, CAA y CAG (en esta relación, A representa adenina, C representa citosina, G representa guanime y T representa timina, respectivamente, y en lo sucesivo igual que anteriormente) .

4. El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos de las posiciones 391 hasta 393 es TAT.

5. El polinucleótido según la reivindicación 3, en el que la base de la posición 390 es C.

6. El polinucleótido según la reivindicación 3, que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 3.

7. Una proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la ID. SEC. Nº: 2; un residuo de aminoácido en la posición 130 a partir del N-terminal de la secuencia de aminoácidos es isoleucina; un residuo de aminoácido en la posición 131 es un residuo de un aminoácido seleccionado de entre un residuo de tirosina, un residuo de serina, un residuo de treonina, un residuo de cisteína, un residuo de asparragina y un residuo de glutamina.

8. La proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos se muestra en la ID. SEC. Nº: 4.

9. Un procedimiento para producir la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7, que comprende; cultivar una célula hospedadora transfected por un Baculovirus integrado con un vector de expresión recombinante con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la ID. SEC. Nº:1, o un transformante obtenido transformando las células hospedadoras con el vector de expresión recombinante, y separar y purificar una proteína a partir del medio de cultivo.

10. Un procedimiento para medir el ácido hialurónico, que comprende;

poner en contacto el ácido hialurónico de una muestra con la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7 para formar un complejo entre el ácido hialurónico y la proteína, hacer reaccionar el complejo con un portador que soporta un anticuerpo específico para la proteína, medir un cambio óptico mediante un aglutinado obtenido a partir de la reacción, y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el portador es látex.

12. Un kit de reactivos para medir el ácido hialurónico, que comprende la proteína con capacidad de unión al ácido hialurónico según la reivindicación 7 como un constituyente.