FAMILIA DE GENES DEL TIPO MSP-3.

Un Polipéptido antigénico de la proteína MSP3.3 de SEQ ID NO:6 que comprende al menos un motivo del tipo MSP-3-c/d como se define en SEQ ID NO:27

Familia de genes del tipo MSP-3.

La presente invención se relaciona con la protección contra la malaria. Más particularmente, la aplicación describe una novedosa familia de genes que abarca el gen MSP-3 ya conocido, y que muestra la redundancia excepcional de los epítopes expuestos, sugiriendo así, que esta familia de genes juega una parte importante en la inmunogenicidad del parásito. La caracterización de esta familia de genes, permite la definición de novedosas composiciones de vacuna e inmunógenas contra P. falciparum.

Los parásitos responsables de la malaria en humanos, incluyendo especialmente el Plasmodium falciparum, muestran diferentes morfologías en el humano huésped y expresan diferentes antígenos como una función de su localización en el organismo del huésped infectado. Las diferencias morfológicas y antigénicas de estos parásitos durante su ciclo de vida en el hombre permiten que al menos cuatro etapas distintas de desarrollo se definan.

La primera etapa de desarrollo del parásito en el hombre corresponde a la forma esporozoite introducida en la sangre del huésped por picaduras de vectores de insecto del parásito. La segunda etapa corresponde al paso del parásito en el hígado y con la infección de las células hepáticas en las cuales los parásitos se desarrollan para formar los esquizontes hepáticos que, cuando son maduros (por ejemplo, en el caso de P. falciparum en el 6º día después de la penetración de los esporozoitos) liberan merozoitos hepáticos mediante rompimiento. La tercera etapa se caracteriza por la infección de los eritrocitos de sangre por las formas asexuales (merozoitos) del parásito; esta etapa de desarrollo eritrocítico corresponde a la fase patogénica de la enfermedad. La cuarta etapa corresponde a la formación de las formas con la potencia sexual (o gametocitos) que llegarán a ser las formas sexuales extracelulares o gametos en el mosquito.

Se ha demostrado repetidamente que los anticuerpos juegan una parte importante en el desarrollo de inmunidad clínica a la malaria por Plasmodium falciparum.

En la actualidad numerosos estudios inmunológicos sugieren que los anticuerpos humanos de las subclases citofílicas (IgG1 y IgG3) son particularmente críticos con el estado de premunición. Esta inmunidad anti-parásito es un tipo de inmunidad cepa-independiente, no-esterilizante que se adquiere después de una exposición prolongada (15-20 años) al parásito. Se observa comúnmente en África y en Papua-Nueva Guinea, pero solo se ha documentado recientemente en el Sud Este de Asia (Soe, Khin Saw et al. 2001). Aunque los anticuerpos pueden actuar directamente sobre la invasión de merozoito de glóbulos rojos, el mecanismo más eficiente in vivo para el control del parásito mediado por el anticuerpo en zonas endémicas requiere de la participación de monocitos (Khusmith and Druilhe 1983); (Lunel and Druilhe 1989). La prueba de inhibición celular dependiente del anticuerpo (ADCI) imita esta cooperación entre los monocitos y los anticuerpos específicos a parásitos citofílicos y se presenta hoy como el mejor marcador sustituto in vitro de inmunidad adquirida contra la etapa sanguínea de P. falciparum.

Dos moléculas hasta ahora han sido identificados como blancos de anticuerpos humanos efectivos de ADCI, a saber la proteína 3 de la superficie del Merozoito de 48-kDa, - de ahora en adelante designada como MSP-3 - (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun et al. 1994) y la proteína rica en Glutamato de 220-kDa, - de ahora en adelante designada como GLURP - (Theisen, Soe et al. 1998). También se ha encontrado que GLURP y MSP-3 pueden inhibir el crecimiento de parásitos in vivo por transferencia pasiva en ratones SCID P. falciparum- humanizados (Badell, Oeuvray et al. 2000). La asociación de anticuerpos humanizados contra MSP-3 con protección clínica también se indica por un número de estudios inmuno-epidemiológicos, que demuestran que los niveles de anticuerpos citofílicos MSP-3 específicos (IgG1 e IgG3) se asocian significantemente con un riesgo reducido del ataque de la malaria (Roussillon 1999). Estos estudios además han mostrado que los anticuerpos IgG3 citofílicos juegan una parte principal en la protección contra la malaria, por lo tanto llevando soportes epidemiológicos con el concepto de que los anticuerpos contra MSP-3 pueden controlar activamente la multiplicación del parásito in vivo por cooperación con los receptores Fc?II que llevan las células (Bouharoun-Tayoun, Oeuvray et al. 1995). Estos receptores muestran afinidad superior para las subclases IgG3 que para las subclases IgG1 (Pleass and Woof 2001). Los principales epitopes de la célula-B reconocidos por estos anticuerpos IgG humanos han sido localizados con las secuencias conservadas en la región MSP-3212-257 (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun et al. 1994; Theisen, Soe et al. 2000; Theisen, Dodoo et al. 2001). La secuenciación de nucleótidos ha demostrado que estos epitopes importantes se conservan altamente entre un número de líneas de laboratorio de P. falciparum y aislados de campo de África y Asia (Huber, Felger et al. 1997); (McColl and Anders 1997).

Trucco et al. (2001) revela la secuencia de las proteínas de las proteínas MSP6 (ahora llamada MSP3.2) y la MSP3 (ahora llamada MSP3.1) y su alineamiento de la secuencia. Oeuvray et al. (1994) revela la identificación de un epitope antigénico (MSP-3b) en la proteína MSP3 y describe sus secuencias de nucleótidos y de proteínas. Este epitope antigénico se encontró utilizando el anticuerpo MoAb 2-45 y se confirmó por la prueba de anticuerpo dirigido contra un péptido MSP-3b sintético. El Número de Acceso Q8IJ53 describe un proteína hipotética de 424 aminoácidos, expresada hipotéticamente a partir de un Marco Abierto de lectura pronosticado in sílico a partir de la secuencia del genoma de Plasmodium falciparum.

Los inventores han caracterizado ahora una serie de 9 genes de P. falciparum, todos agrupados en el 3' terminal del cromosoma 10, que codifica las proteínas y epitopes dentro, que son todos blancos para los anticuerpos que ocurren naturalmente en individuos expuestos a la malaria, la mediación de la destrucción de la etapa eritrocítica de P. falciparum por cooperación con monocitos sanguíneos, y que muestran un grado inusual de la conservación de la secuencia entre los diversos P. falciparum aislados.

La presente aplicación revela una familia de genes aislados, denominada la familia del tipo MSP-3, los productos de la cual tienen características comunes estructurales e inmunológicas, así como a algunos de estos genes y las proteínas correspondientes, tomados individualmente.

Los polipéptidos antigénicos como se revela en las reivindicaciones que comprenden epitopes de dichas proteínas novedosas, así como las composiciones polipeptídicas antigénicas que comprenden al menos dos de dichos epitopes, también son parte de la invención.

Otros aspectos importantes de la invención son composiciones y vacunas inmunógenas contra la malaria, que comprenden como un inmunógeno un polipéptido o una composición polipeptídica como se menciona anteriormente.

Los anticuerpos recombinantes y parte de estos, que reaccionan en cruz con varios productos de la familia de genes del tipo MSP-3, también se revelan, ya sea tomados como tales o en un medicamento para inmunoterapia pasiva o en un kit para el diagnóstico in vitro de la malaria.

La aplicación revela métodos para el diagnóstico in vitro de la malaria en un individuo, ya sea utilizando un polipéptido antigénico, o utilizando un anticuerpo como se define anteriormente, así como kits que comprenden al menos parte de los reactivos necesarios (polipéptidos, anticuerpos ...) para realizar estos métodos.

Las secuencias de nucleótidos que codifican al menos uno de los antígenos novedosos P. falciparum, y su uso en un medicamento o una vacuna de ácido nucleico contra P. falciparum, también se revelan.

Durante todo el presente texto, un número de términos se utilizan, que se deberían entender de acuerdo con las siguientes definiciones:

En lo que sigue, el término "gen" es sinónimo de bien una "secuencia que ocurre naturalmente" incluyendo una secuencia codificante, o de una secuencia recombinante o sintética incluyendo una secuencia codificante. En el presente texto, un "gen" tampoco necesariamente contiene elementos reguladores, contrariamente a la aceptación de...

1. Un Polipéptido antigénico de la proteína MSP3.3 de SEQ ID NO:6 que comprende al menos un motivo del tipo MSP-3-c/d como se define en SEQ ID NO:27.

2. Un polipéptido antigénico de la proteína MSP3.3 de SEQ ID NO:6 que comprende al menos un motivo del tipo MSP-3-c/d, obtenido por sustitución conservadora de al menos un aminoácido de SEQ ID NO:27, siendo dicho motivo reconocido por un anticuerpo dirigido contra el motivo del tipo MSP-3-c/d como se define en SEQ ID NO:27, a condición que dicho polipéptido antigénico no sea un fragmento de MSP-3-1 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de MSP-3-2 de la SEQ ID NO: 4.

3. Un polipéptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende al menos un motivo del tipo MSP-3-c/d, que muestra al menos 90% de identidad con el motivo según se define en SEQ ID NO:27.

4. Un polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende al menos un motivo del tipo MSP-3-b, que tiene una secuencia seleccionada entre la secuencia de SEQ ID Nos: 17 a 24.

5. Una composición polipeptídica antigénica que comprende un motivo del tipo MSP-3-c/d como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos otro motivo del tipo MSP-3-c/d seleccionado en el grupo que consiste de:

a. SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30;

b. un motivo del tipo MSP-3-c/d obtenido por la sustitución conservadora de al menos un aminoácido en una secuencia seleccionada en el grupo que consiste en tener una secuencia de SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30, siendo dicho motivo reconocido por un anticuerpo dirigido contra cualquier motivo del tipo MSP-3-c/d como se define en SEQ ID NO:25 a SEQ 10 NO:30; y

c. un motivo del tipo MSP-3-c/d que muestra al menos 90% de identidad con SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30.

6. Una composición de polipéptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende un motivo del tipo MSP-3-c/d, como se define en SEQ ID NO:27 y al menos otro motivo del tipo MSP-3-c/d seleccionado en el grupo que consiste de SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30.

7. Una composición de polipéptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 5 o 6. En donde los citados al menos dos motivos del tipo MSP-3-c/d diferentes, se llevan por moléculas distintas.

8. Una composición de polipéptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde dichos al menos dos motivo del tipo MSP-3-c/d diferentes se llevan por una molécula única.

9. La composición polipeptídica antigénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, que además comprende un polipéptido antigénico que comprende al menos 10 residuos de aminoácidos consecutivos de la región R0 de GLURP.

10. La composición polipeptídica antigénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que es un mixotope que comprende los péptidos sintéticos que comprenden la secuencia:

L-X₁X₂X₃-X₄-X₃-X₅-X₆-X₇-D-X₈-X₉-X₁₀-I-X₁₁-X₁₂X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆ hskip1cm (SEQ ID No:33),

en donde:

X₁ = E, o S;

X₂ = L, H, S o Q;

X₃ = I, V o L;

X₄ = K, N, Y o P;

X₅ = T, S o P;

X₆ = S o L;

X₇ = K, W o S;

X₈ = E, K, R o I;

X₉ = E o N;

X₁₀ = D, N o Q;

X₁₁ = I, V, S, P o A;

X₁₂ = K, D o N;

X₁₃ = H o E;

X₁₄ = N o S;

X₁₅ = E o D; y

X₁₆ = D o Q.

11. La composición polipeptídica antigénica de acuerdo con la reivindicación 10, que es una mezcla de al menos 50, al menos 100, o al menos 500 péptidos de diferentes secuencias.

12. El polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición polipeptídica antigénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde una molécula lipídica se une a al menos parte de las moléculas polipeptídicas.

13. El polipéptido antigénico o composición polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la molécula lipídica es un residuo C-terminal palmitoilisilamida.

14. El polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición polipeptídica antigénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, en donde al menos parte de las moléculas polipeptídicas se unen a un soporte.

15. El polipéptido antigénico o composición polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el soporte es partículas virales, o perlas de nitrocelulosa o poliestireno, o un polímero biodegradable

16. El polipéptido antigénico o la composición polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho polímero biodegradable es el lipofosfoglicano o el ácido poli-L láctico.

17. Una composición inmunógena que comprende, como un inmunógeno, un polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 12 a 16, o una composición polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15.

18. Una vacuna contra la malaria que comprende, como un inmunógeno, un polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 12 a 16, o una composición polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, en asociación con un vehículo farmacéutico apropiado.

19. La composición inmunógena de la reivindicación 17 o la vacuna de la reivindicación 18, que además comprende al menos un antígeno seleccionado entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP y GLURP.

20. La composición inmunógena o la vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que se formula para inyección intradérmica o intramuscular.

21. La composición inmunógena o vacuna de la reivindicación 20, que comprende entre 1 y 100 µg de inmunógeno por dosis de inyección.

22. La composición inmunógena o la vacuna de la reivindicación 20, que comprende entre 2 y 50 µg de inmunógeno por dosis de inyección.

23. La composición inmunógena o la vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que además comprende SBAS2 y/o Alum y/o Montanide como un adyuvante.

24. Uso de un polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 12 a 16, o una composición polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, para la preparación de una composición de vacuna contra la malaria.

25. Un anticuerpo sintético o recombinante dirigido contra el motivo del tipo MSP-3-c/d de un polipéptido antigénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

26. Una mezcla de anticuerpos dirigidos contra una composición polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16.

27. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 25, o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dichos anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados.

28. Uso de una composición que comprende un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para la preparación de un medicamento contra la malaria.

29. Un medicamento para una inmunoterapia pasiva de la malaria, que comprende un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27.

30. El medicamento de la reivindicación 29, que además comprende anticuerpos dirigidos contra al menos un antígeno seleccionado entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP y GLURP.

31. Un método para el diagnóstico in vitro de la malaria en un individuo que puede ser infectado por P. falciparum, que comprende la puesta de una muestra biológica de dicho individuo en contacto con un polipéptido antigénico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en condiciones que permitan la formación de complejos antígeno/anticuerpo entre dicho péptido o polipéptido antigénico y los anticuerpos, posiblemente presentes en la muestra biológica, y la detección in vitro de los complejos antígeno/anticuerpo posiblemente formados.

32. El método de la reivindicación 31, en donde el diagnóstico in vitro se realiza por una prueba de ELISA.

33. El método de la reivindicación 31 o 32, en donde la muestra biológica además se pone en contacto con uno o varios péptidos antigénicos que se originan de otros antígenos seleccionados entre LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP-3-1, MSP-3-2, MSP-3-5, MSP-3-6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP y GLURP.

34. Un kit para el diagnóstico in vitro de la malaria, que comprende al menos un polipéptido antigénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

35. El kit de la reivindicación 34, en donde el péptido o polipéptido antigénico se une a un soporte.

36. El kit de la reivindicación 34 o 35, que además comprende los reactivos que permiten la formación de complejos antígeno/anticuerpo entre dicho péptido o polipéptido antigénico y los anticuerpos posiblemente presentes en una muestra biológica, y los reactivos que permiten la detección in vitro de los complejos antígeno/anticuerpo posiblemente formados.

37. Un método para el diagnóstico in vitro de la malaria en un individuo que puede ser infectado por P. falciparum, que comprende la puesta de una muestra biológica de dicho individuo en contacto con los anticuerpos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en condiciones que permitan la formación de complejos antígeno/anticuerpo entre dichos anticuerpos y los antígenos específicos para P. falciparum, posiblemente presentes en la muestra biológica, y la detección in vitro de los complejos antígeno/anticuerpo posiblemente formados.

38. Un kit para el diagnóstico in vitro de la malaria, que comprende los anticuerpos como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27.

39. El kit de la reivindicación 38, que además comprende los reactivos que permiten la formación de los complejos antígeno/anticuerpo entre dichos anticuerpos y antígenos a partir de las proteínas de la familia MSP-3 posiblemente presentes en una muestra biológica, y los reactivos que permiten la detección in vitro de los complejos antígeno/anticuerpo posiblemente formados.

40. Una secuencia de nucleótido recombinante que codifica un polipéptido antigénico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

41. La secuencia de nucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 40, que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión que comprende varios motivos del tipo MSP-3-c/d, en donde al menos dos de dichos motivos se seleccionan entre los motivos de SEQ ID NOs: 25 a 30.

42. Una clonación recombinante y/o vector de expresión, que comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 41.

43. La clonación recombinante y/o vector de expresión de la reivindicación 42, en donde la secuencia de nucleótido está bajo el control de un promotor y elementos reguladores de la expresión en una célula huésped, siendo dicho promotor y elementos reguladores homólogos o heterólogos vis-à-vis la célula huésped.

44. Uso de un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 43, para la preparación de un medicamento para inmunización genética contra Plasmodium falciparum.

45. Una vacuna de ADN que comprende una secuencia de nucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 40 a 41.

46. Una célula huésped recombinante, que se transforma por el vector de la reivindicación 42 o 43.

47. La célula huésped de la reivindicación 46, que es una bacteria, una levadura, una célula de insecto, o una célula de mamífero.

48. Un polipéptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 12 a 16, o una composición polipeptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, para utilizar como una composición de vacuna contra la malaria.

49. Una composición que comprende un anticuerpo o una mezcla de anticuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, para utilizar como un medicamento contra la malaria.

50. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 42 o 43, para utilizar como un medicamento para inmunización genética contra Plasmodium falciparum.