Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado,

que comprende:

cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;

añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula; en el que el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite una primera fluorescencia en presencia de actividad de esterasa intracelular; en el que el colorante fluorescente que no permea la célula puede penetrar en membranas comprometidas de células y emitir una segunda fluorescencia; y en el que la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia pueden distinguirse entre sí cuando el reactivo indicador comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula;

incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado; y

determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos un parámetro seleccionado de entre el grupo constituido por: intensidad de la primera fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra hasta el punto más distante en la muestra en el que se detecta la primera fluorescencia; una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra al punto más distante de la muestra en el que se detecta la segunda fluorescencia

Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado.

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud de patente reivindica la prioridad de la solicitud provisional nº 60/552.778, presentada el 12 de marzo de 2004, y de la solicitud provisional nº 60/553.059, presentada el 15 de marzo de 2004.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la detección y evaluación de la frescura o del grado de degradación o de deterioro de un producto basado en proteínas, a modo de indicación del grado de calidad del producto basado en proteínas.

Los documentos de la técnica anterior dan a conocer procedimientos de análisis de la viabilidad de muestras celulares o de muestras de tejido, que comprenden calceína-AM, homodímero de EtD-1 y/o azul tripán. Estos procedimientos ni enseñan ni sugieren la utilización de colorantes en la industria alimentaria. En particular, dichos procedimientos no se utilizan para evaluar la frescura de un producto de pescado. Los procedimientos de este tipo se dan a conocer en los documentos de la técnica anterior siguientes: patente US nº 5.534.416, nº 5.314.805; P.L. Moore et al., Journal of Cell Biology 5(2):58A, 1990, y J.R. Tennant, Transplantation United States 2:685-694, 1964.

Entre los procedimientos tradicionales para evaluar la frescura o grado de deterioro del pescado se incluyen la evaluación sensorial (apariencia, tacto y olor). Este procedimiento es subjetivo y debatible. La publicación de G. Olafsdttir et al., Trends in Food Science & Technology 8:258-265, 1997, da a conocer no sólo un procedimiento de este tipo, sino también procedimientos para evaluar la frescura del pescado que comprenden procedimientos microbiológicos, evaluaciones de compuestos volátiles, cambios en las proteínas musculares, etc. Sin embargo, dicho documento no contiene enseñanza de procedimientos que evalúen la frescura del pescado mediante la tinción de muestras de pescado utilizando colorantes.

La patente US nº 5.744.321 da a conocer un procedimiento colorimétrico para evaluar rápidamente el grado de degradación bacteriana de pescado, tal como bacalao, rape y lenguado de invierno, mediante la mezcla de músculo de pescado con un caldo nutritivo bacteriano, y haciendo reaccionar el extracto con un cromógeno soluble en agua, tal como una sal de colorante tetrazolio ionizado que experimenta una reacción de reducción con las bacterias del pescado, produciendo un colorante formazán insoluble en agua o producto de reacción coloreado. A continuación, se añade un agente activo en superficie para ayudar a solubilizar el colorante formazán formado, y para producir la lisis y detener la reacción, y se añade un solvente alcohol alifático para disolver el colorante formazán añadido o producto de reacción coloreado, y para impedir la degradación posterior y el oscurecimiento con el tiempo. El producto de reacción disuelto presenta un color que se intensifica dependiendo de la población bacteriana de la muestra de pescado y que puede evaluarse colorimétricamente mediante comparación visual con un gráfico de colores estándares indicativos de poblaciones bacterianas reducidas, intermedias o abundantes. Este procedimiento resulta complicado debido a que comprende bastantes etapas y reactivos.

Por lo tanto, todavía existe una necesidad de proporcionar un procedimiento exacto, conveniente y objetivo para evaluar la frescura de un producto de pescado para proveedores de pescado, restaurantes, compañías de restauración y de catering, etc.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:

cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado,

añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula,

incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado, y

determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos uno de los parámetros siguientes: intensidad de una primera fluorescencia emitida por la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida por la muestra incubada y una primera distancia entre la parte superior de la muestra y el punto más distante de la muestra en que se detecta la segunda fluorescencia.

En presencia de actividad esterasa intracelular, el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite la primera fluorescencia. El colorante fluorescente que no permea la célula no cruza membranas intactas de células vivas, aunque puede penetrar en membranas celulares comprometidas y emitir la segunda fluorescencia. En el caso de que el reactivo de tinción comprenda tanto colorante que permea la célula como colorante que no permea la célula, la primera fluorescencia debería poder distinguirse de la segunda fluorescencia, es decir, emiten diferentes colores fluorescentes. Entre los ejemplos del colorante que permea la célula se incluyen la calceína-AM y la resazurina-C12. Entre los ejemplos del colorante que no permea la célula se incluyen homodímero de EtD-1, colorante verde Sytox® y colorante YoYo-1.

Además, el colorante que permea la célula, tal como calceína-AM y resazurina-C12, puede utilizarse en combinación con colorante azul tripán. La tinción con colorante azul tripán depende de la pérdida de la integridad de la membrana en las células muertas. El colorante azul tripán normalmente resulta excluido por las membranas celulares intactas. En general, en el caso de que las células se encuentren muertas, son permeables al colorante azul tripán. De esta manera, el colorante azul tripán puede desactivar la fluorescencia de las células muertas conjuntamente con el colorante que permea las células. La reducción de fluorescencia tras la adición de azul tripán puede ser una medida de la proporción de células muertas.

Según una forma de realización de la presente invención, la etapa de determinación puede llevarse a cabo mediante la comparación de por lo menos un parámetro con una correlación preestablecida entre la frescura y por lo menos un parámetro.

Las intensidades de las primera y segunda fluorescencias pueden cuantificarse con un dispositivo digital, y la correlación preestablecida puede establecerse basándose en las intensidades cuantificadas de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia.

Según otra forma de realización de la presente invención, las primera y segunda fluorescencias pueden registrarse en una imagen con un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y la intensidad de por lo menos uno de entre la primera y la segunda fluorescencias puede ilustrarse en un gráfico de color estándar.

Preferentemente, el reactivo de tinción comprende una cantidad efectiva de calceína-AM y una cantidad efectiva de homodímero de EtD-1. La frescura del primer producto en este caso puede determinarse basándose en la fluorescencia roja (homodímero de EtD-1) y en la fluorescencia verde (calceína) emitida por la muestra.

Según todavía otra forma de realización de la presente invención, el colorante fluorescente que no permea las células, contenido en el reactivo de tinción es el colorante azul tripán. La frescura del primer producto en este caso puede determinarse basándose en el color azul que aparece en la muestra. Preferentemente, la frescura se determina basándose en la distancia a la que penetra el colorante azul tripán dentro de la muestra, en la que un pescado más fresco corresponde a una distancia de penetración más corta.

Otros objetivos y características se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente, considerada haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Sin embargo, debe entenderse que los dibujos se han proporcionado únicamente a título ilustrativo y no limitativo de la invención, para los cuales debe hacerse referencia a las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse también que los dibujos no se han dibujado necesariamente a escala y que, a menos que se indique lo contrario, pretenden únicamente ilustrar conceptualmente las estructuras y los procedimientos descritos en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos:

la figura 1...

1. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:

cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;

añadir sobre la muestra una cantidad efectiva de un reactivo de tinción que comprende por lo menos un colorante que permea la célula y un colorante fluorescente que no permea la célula; en el que el colorante que permea la célula se convierte en un compuesto que emite una primera fluorescencia en presencia de actividad de esterasa intracelular; en el que el colorante fluorescente que no permea la célula puede penetrar en membranas comprometidas de células y emitir una segunda fluorescencia; y en el que la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia pueden distinguirse entre sí cuando el reactivo indicador comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula;

incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado; y

determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos un parámetro seleccionado de entre el grupo constituido por: intensidad de la primera fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, la intensidad de una segunda fluorescencia emitida a partir de la muestra incubada, una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra hasta el punto más distante en la muestra en el que se detecta la primera fluorescencia; una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra al punto más distante de la muestra en el que se detecta la segunda fluorescencia.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación se lleva a cabo mediante la comparación de por lo menos un parámetro con una correlación preestablecida entre la frescura y dicho por lo menos un parámetro.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que las intensidades de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se cuantifican mediante un dispositivo digital, y la correlación preestablecida se establece basándose en las intensidades cuantificadas de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que las intensidades de la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se registran en una imagen mediante un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y la intensidad de por lo menos una de entre la primera fluorescencia y la segunda fluorescencia se ilustra en un gráfico de color estándar.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el reactivo de tinción comprende tanto el colorante que permea la célula como el colorante que no permea la célula.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la determinación de la frescura del producto de pescado se basa en la proporción de las intensidades de la primera fluorescencia y de la segunda fluorescencia.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la determinación de la frescura del producto de pescado se basa en la proporción de la primera distancia y la segunda distancia.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el colorante que permea la célula es calceína-AM (calceína-acetoximetil éster o 3',6'-di(O-acetil-2',7'-bis[N,N-bis(carboximetil)-aminometil]fluoresceíntetraacetoximetil éster), y el colorante que no permea la célula es homodímero de EtD-1 (homodímero de etidio-1), siendo la primera fluorescencia verde y la segunda fluorescencia roja.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el colorante que permea la célula se selecciona de entre el grupo constituido por calceína-AM y resazurina-C12, y el colorante que no permea la célula se selecciona de entre el grupo constituido por homodímero de EtD-1 y YoYo-1.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el reactivo de tinción comprende además colorante azul tripán cuando el reactivo de tinción comprende el colorante que permea la célula.

11. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:

cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;

añadir un reactivo de tinción que comprende una cantidad efectiva de calceína-AM y una cantidad efectiva de homodímero de EtD-1 sobre la muestra;

incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado;

determinar la frescura del producto de pescado basándose en por lo menos una de entre la intensidad de una fluorescencia verde y una primera distancia a partir de la parte superior de la muestra incubada y el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia verde, y por lo menos uno de entre la intensidad de una fluorescencia roja y una segunda distancia a partir de la parte superior de la muestra incubada y el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia roja.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la determinación de la frescura se basa en la proporción de las intensidades de la fluorescencia verde y de la fluorescencia roja.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la determinación de la frescura se basa en la proporción de la primera distancia y la segunda distancia.

14. Procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, en el que la determinación de la frescura se lleva a cabo mediante la comparación de las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja con una correlación preestablecida entre la frescura y las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se cuantifican utilizando un dispositivo digital, y se establece la correlación preestablecida basándose en las intensidades cuantificadas de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se registran en una imagen utilizando un dispositivo óptico, y la correlación preestablecida entre la frescura y las intensidades de la fluorescencia verde y la fluorescencia roja se ilustra en un gráfico de color estándar.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el reactivo de tinción comprende calceína-AM de 0,1 a 50 µM.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el reactivo de tinción comprende homodímero de EtD-1 de 0,1 a 100 µM.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en el que la cantidad del reactivo de tinción de 1 µl a 1 ml.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en el que la duración predeterminada de la etapa de incubación es de 1 a 45 minutos.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en el que la duración predeterminada de la etapa de incubación es de 5 a 10 minutos, y la etapa de incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el producto de pescado se selecciona de entre el grupo constituido por salmón, trucha arco iris, lenguado y fletán.

23. Procedimiento para evaluar la frescura de un producto de pescado, que comprende:

cortar una cantidad pequeña de muestra del producto de pescado;

añadir un reactivo de tinción que comprende una cantidad efectiva de colorante azul tripán sobre la muestra;

incubar la muestra a la que se ha añadido el reactivo de tinción durante un periodo predeterminado;

determinar la frescura del producto de pescado basándose en una distancia de penetración a partir de la parte superior de la muestra incubada hasta el punto más distante en la muestra incubada en el que se detecta la fluorescencia azul.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la determinación de la frescura se lleva a cabo mediante la comparación de la distancia de penetración y una correlación preestablecida entre la frescura y la distancia de penetración.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que el reactivo de tinción comprende colorante azul tripán 0,1 a 10 mM.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que la cantidad del agente de tinción se encuentra comprendida entre 1 µl y 1 ml.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que el periodo de tiempo predeterminado de la etapa de incubación es de 2 minutos a 45 minutos.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que el periodo de tiempo predeterminado de la etapa de incubación es de 10-30 minutos, y la incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente.