Un anticuerpo neutralizante que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

27 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33

Epítopo Neutralizable de HGF y Anticuerpo Neutralizante que se une al mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo neutralizante contra HGF que es capaz de neutralizar HGF como un agente único uniéndose a un epítopo neutralizable de HGF.

Antecedentes de la invención

HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) es un polipéptido heterodimérico multifuncional producido por células mesenquimales. HGF está compuesto de una cadena alfa que contiene un dominio N-terminal y cuatro dominios kringle (NK4) unidos covalentemente a un dominio C-terminal de la cadena beta similar a una serín-proteasa (véase la figura 1). El HGF humano se sintetiza como un precursor de cadena única biológicamente inactivo que consiste en 728 aminoácidos con un péptido señal de 29 aminoácidos que no está presente en la proteína madura. El HGF biológicamente activo se logra mediante corte en el residuo R494 por una serín-proteasa extracelular de suero específica. El HGF activo así logrado es un heterodímero completamente activo que está compuesto de la cadena alfa de 69 kDa y la cadena beta de 34 kDa unidas por puentes disulfuro. Sin embargo, la estructura terciara global de HGF es aún desconocida y todavía no se ha clarificado cuál de estos dominios es responsable para las funciones específicas de HGF (Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 13(1): 1-59, 2002).

La unión de HGF a su receptor, Met, induce crecimiento y dispersión de varios tipos de células, media las transiciones epiteliales mesenquimales y la formación de túbulos y lúmenes y fomenta la angiogénesis. Tanto los ratones deficientes en Met como en HGF son letales en fases embrionarias y muestran defectos de desarrollo en la placenta, hígado fetal y formación de extremidades/músculos (Cao et al., PNAS 98(13): 7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American Journal of Pathology 159(2): 579-590, 2001).

Met se aisló originalmente como producto de un oncogén humano, trp-met, que codifica una proteína quinasa modificada constitutivamente activa con actividad transformante. También se ha mostrado que la activación de Met aumenta notablemente la propagación metastásica del cáncer que proviene de su influencia estimuladora de procesos tales como angiogénesis, motilidad celular y regulación de proteasas de la superficie celular (Wielenga et al., American Journal of Pathology 157(5): 1563-1573, 2000). Puesto que se ha descrito que Met se sobreexpresa en varios cánceres humanos de hígado, próstata, colon, mama, cerebro y piel (Maulik et al., supra), se ha considerado como un factor diana importante para la prevención y tratamiento del cáncer. Además, se ha descrito que la infección de malaria depende de la activación del receptor de HGF por HGF secretado y, según esto, se han identificado HGF y su receptor como potenciales dianas para nuevos planteamientos para la prevención de la malaria (Carrolo M, et al., Nat. Med. 9(11): 1363-1369, 2003). También se ha descubierto la posibilidad de que HGF se pueda encontrar en asociación con los cambios patológicos que se producen en la enfermedad de Alzheimer (Fenton H, et al., Brain Res. 779(1-2): 262-270, 1998). Además, se ha encontrado que HGF está definitivamente implicado en aumentar los procesos de cicatrización cutánea, incluyendo reepitelización, neovascularización y formación de tejido de granulación (Yoshida S, et al., J. Invest. Dermatol. 120(2): 335-343, 2003).

Mientras tanto, la neutralización selectiva de factores de crecimiento o citoquinas asociados a tumores y sus receptores, que desempeñan papeles cruciales en el desarrollo y propagación del cáncer, ha sido siempre una estrategia atractiva para el desarrollo de fármacos anticáncer. Recientemente, se han desarrollado numerosos anticuerpos monoclonales (AcM) terapéuticos para estas dianas, por ejemplo, herceptin y AcM humanos anti-angiopoyetina usando tecnologías de anticuerpos recombinantes tales como presentación en fago de librerías combinatorias de anticuerpos.

Se sabe bien que los anticuerpos policlonales contra HGF bloquean muchas de las funciones biológicas de HGF. Además, se ha descrito recientemente que las mezclas de AcM neutralizantes contra HGF muestran actividad antitumoral en modelos animales (Cao et al., PNAS 198(13): 7443-7448, 2001). En particular, Cao y col. divulgaron que se necesitan bloquear tres o más epítopos, posiblemente dos para el receptor Met y uno para heparina, para inhibir la actividad de HGF in vivo e in vitro, y una mezcla de al menos 3 AcM es capaz de neutralizar HGF en un experimento in vitro.

Además, Di Nicola et al. (Blood 99(10): 3838-3843, 2002) divulgaron un anticuerpo anti HGF que inhibía la proliferación de linfocitos T suprimida por BMSC fomentada por rhHGF.

Sin embargo, no se ha descrito ningún anticuerpo monoclonal que puede neutralizar HGF como un agente único e inhibir la actividad de dispersión celular in vitro.

Compendio de la invención

Según esto, la presente invención proporciona:

1. Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_H que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una región V_L que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.

2. Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_H que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región V_L que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, y en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.

3. El anticuerpo neutralizante de 1 o 2, que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo humanizado.

4. El anticuerpo neutralizante de 1 o 2, que es un Fab.

Breve descripción de las figuras

Lo anterior y otros objetos y características de la invención se harán aparentes de la siguiente descripción de la invención, cuando se tomen junto con las figuras acompañantes que respectivamente muestran:

Figura 1: la estructura de HGF;

Figura 2: el mapa genético del vector fagémido pComb3X usado para la construcción de la librería de anticuerpos,

A: el caso de presentación de Fab en la superficie del fagémido, y

B: el caso de presentación de scFv o diacuerpos en la superficie de fagémido.

Figura 3: enriquecimiento del conjunto de fagos que presentan Fab que se unen específicamente a HGF mediante la adsorción durante el cultivo de clones que se unen a HGF,

Figura 4: el resultado de la tinción de los fragmentos Fab purificados con azul de coomassie,

1: marcador,

2: anticuerpo del clon 68 no reducido (50.000 Da) y

3: anticuerpo del clon 68 reducido (25.000 Da)

Figura 5: el resultado del análisis de inmunotransferencia para determinar si los fragmentos Fab purificados se expresan,

Figura 6: el nivel de unión de un fago que contiene el epítopo neutralizable inventivo a c-MET,

1: fago que contiene el péptido de SEQ ID NO: 32,

2: fago que contiene el péptido de SEQ ID NO: 33 y

3 y 4: fagos control que no contienen el péptido de SEQ ID NO: 32 o 33

Figura 7: la unión específica de los Fab de los clones 61 y 68 a HGF, respectivamente,

Figura 8: dependencia de la conformación del epítopo neutralizable inventivo definido por los clones 61 y 68, respectivamente,

A: clon 61,

B: clon 68,

Carril 1: HGF no reducido y

Carril 2: HGF reducido

Figura 9a: los criterios que muestran el nivel de dispersión celular que varía de los grados 1 a 6,

Figura 9b: el resultado del ensayo de dispersión que muestra los niveles de dispersión de los Fab anti-HGF y los anticuerpos anti-Fab humano cambian con las concentraciones de HGF añadido,

Figura 10: la cantidad de anticuerpo del clon 68 unido a HGF inmovilizado en un chip sensor CM5 aumenta con la cantidad inyectada de anticuerpo del clon 68,

I: inyección de Fab no específico,

II: inyección de anticuerpo del clon 68 50 nM,

III: inyección...

1. Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_H que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una región V_L que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.

2. Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_H que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región V_L que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, y en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.

3. El anticuerpo neutralizante de la reivindicación 1 o 2, que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo humanizado.

4. El anticuerpo neutralizante de la reivindicación 1 o 2, que es un Fab.