Proceso para la producción de jarabe, comprendiendo someter almidón granulado a una enzima híbrida en medio acuoso,

donde la enzima híbrida comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos

Enzimas híbridas.

Referencia a un listado de secuencias

Esta aplicación contiene un Listado de Secuencias en forma legible para el ordenador.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a un híbrido entre al menos un módulo de unión a carbohidratos ("CBM") y al menos el módulo catalítico (CM) de una glucoamilasa. La invención también se refiere al uso de la enzima híbrida en un proceso de almidón en el cual se degrada almidón granulado en azúcares, p. ej., un jarabe, o el cual se puede usar como nutriente para levaduras en la producción de un producto de fermentación, tal como especialmente etanol.

Se ha descrito un gran número de procesos para convertir almidón en hidrolizados de almidón, tales como maltosa, glucosa o jarabes especializados, ya sea para usarse como edulcorantes o como precursores para otros sacáridos tales como fructosa. La glucosa también puede fermentarse a etanol u otros productos de fermentación.

El almidón es un polímero de alto peso molecular que consiste en cadenas de unidades de glucosa. Normalmente consiste en aproximadamente un 80% de amilopectina y un 20% de amilosa. La amilopectina es un polisacárido ramificado en el cual las cadenas lineales de residuos de alfa-1,4-D-glucosa se unen por enlaces alfa-1,6-glucosídicos.

La amilosa es un polisacárido lineal formado por unidades D-glucopiranosa enlazadas juntas por enlaces alfa-1,4-glucosídicos. En el caso de convertir almidón en un hidrolizado de almidón soluble, el almidón se despolimeriza. El proceso de despolimerización convencional consiste en una etapa de gelatinización y dos etapas de proceso consecutivas, llámense un proceso de licuefacción y un proceso de sacarificación.

El almidón granulado consiste en gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando una suspensión de almidón acuosa se calienta, los gránulos se hinchan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" se da un dramático incremento en la viscosidad. Ya que el nivel de sólidos es del 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que adelgazarse o "licuarse" para que se pueda manejar. Esta reducción en la viscosidad se obtiene actualmente en gran parte por la degradación enzimática. Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades ramificadas y lineales más pequeñas (maltrodextrinas) por una alfa-amilasa. El proceso de licuefacción se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 105-110ºC durante aproximadamente 5 a 10 minutos seguido por aproximadamente 1-2 horas a una temperatura de aproximadamente 95ºC. La temperatura se baja después a 60ºC, se agregan una gluco-amilasa o una beta-amilasa y opcionalmente una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa o una pululanasa, y el proceso de sacarificación procede durante aproximadamente 24 a 72 horas.

Los procesos de conversión de almidón convencionales consumen mucha energía debido a los diferentes requerimientos en términos de temperatura durante las diferentes etapas. Es entonces deseable poder seleccionar y/o diseñar enzimas usadas en el proceso de tal forma que el proceso total pueda llevarse a cabo sin tener que gelatinizar el almidón.

Resumen de la invención

La invención proporciona en un primer aspecto una enzima híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico que tiene actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos. El módulo catalítico puede ser preferentemente de origen fúngico, bacteriano o vegetal.

En otros aspectos la invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un constructo de ADN comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, un vector de expresión comprendiendo la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto, y una célula huésped transformada con un vector; dicha célula huésped siendo capaz de expresar la secuencia de ADN que codifica la enzima híbrida del primer aspecto.

En un aspecto final la invención proporciona procesos para producir jarabe o un producto de fermentación a partir de almidón granulado comprendiendo someter el almidón crudo a una alfa-amilasa y a una enzima híbrida teniendo actividad glucoamilasa de la invención en un medio acuoso. Si se desea un producto de fermentación el proceso incluye la presencia de un organismo de fermentación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 compara el rendimiento de etanol por gramo de DS de dos híbridos glucomilasa-SBM (Módulo de Unión a Almidón) (TEAN-1 y TEAN-3) que comprenden el dominio catalítico de T. emersonii y el SBM de A. niger con la glucoamilasa de Talaromyces emersonii de tipo silvestre.

Descripción detallada de la invención

El término "almidón granulado" se entiende como almidón crudo no cocido, es decir, almidón que no se ha sometido a una gelatinización. El almidón se forma en plantas como pequeños gránulos insolubles en agua. Estos gránulos se conservan en almidones a temperaturas inferiores a la temperatura de gelatinización inicial. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos pueden absorber una pequeña cantidad de líquido. Hasta 50ºC a 70ºC el hinchamiento es reversible, dependiendo el grado de reversibilidad del almidón particular. Con temperaturas más altas comienza un hinchamiento irreversible llamado gelatinización.

El término "temperatura de gelatinización inicial" se entiende como la temperatura mínima a la que comienza la gelatinización del almidón. El almidón calentado en agua se empieza a gelatinizar entre 50ºC y 75ºC; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y se puede determinar fácilmente por el experto en la materia. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie vegetal, la variedad particular de la especie vegetal así como con las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la cual la birrefringencia se pierde en un 5% de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stärke, Vol. 44 (12) págs. 461-466 (1992).

El término "hidrolizado de almidón soluble" se entiende como los productos solubles del proceso de la invención y pueden comprender mono-, di-, y oligosacáridos, tales como glucosa, maltosa, maltodextrinas, ciclodextrinas y cualquier mezcla de éstas. Preferiblemente al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos el 99% de los sólidos secos del almidón granulado se convierten en un hidrolizado de almidón soluble.

El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usan los ajustes siguientes para comparar las secuencias de aminoácidos: penalización de creación GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.

El término "homología" de polipéptidos se entiende como el grado de identidad entre dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. La homología puede determinarse adecuadamente mediante programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, 10 de agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usan los siguientes escenarios para la comparación de secuencias de aminoácidos: penalización de creación GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1.

Enzimas híbridas

Los números de clasificación de enzimas (números EC) referidos en la presente descripción con las...

1. Proceso para la producción de jarabe, comprendiendo someter almidón granulado a una enzima híbrida en medio acuoso, donde la enzima híbrida comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos.

2. Proceso según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos es de origen fúngico, preferiblemente derivado de Aspergillus sp, Athelia sp. o Talaromyces sp.

3. Proceso según la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos se deriva de Aspergillus kawachii, así como el CBM teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 2, o la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM) se deriva de Aspergillus Niger, preferiblemente el CBM teniendo la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 18, o la secuencia de aminoácidos del módulo de unión a carbohidratos (CBM) se deriva de Athelia sp., preferiblemente de Athelia rolfsii, especialmente la secuencia de aminoácidos de CBM mostrada en la SEC ID nº: 28.

4. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el módulo catalítico es una glucoamilasa de origen fúngico, preferiblemente derivada de una cepa de Aspergillus, preferiblemente de una cepa de Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae, especialmente la secuencia mostrada en la SEC ID nº: 24; Athelia, preferiblemente Athelia rolfsii; especialmente la secuencia mostrada en la SEC ID nº: 26; Talaromyces, preferiblemente Talaromyces emersonii, especialmente la secuencia mostrada en la SEC ID nº: 25.

5. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el almidón granulado se somete posteriormente a una alfa-amilasa.

6. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, preferiblemente derivada de un hongo, preferiblemente del género Aspergillus, especialmente Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae.

7. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el jarabe es glucosa o maltosa.

8. Proceso de producción de un producto de fermentación, comprendiendo someter almidón granulado a una enzima híbrida en medio acuoso en presencia de un organismo de fermentación, donde la enzima híbrida comprende una secuencia de aminoácidos de un módulo catalítico teniendo actividad glucoamilasa y una secuencia de aminoácidos de un módulo de unión a carbohidratos.

9. Proceso según la reivindicación 8, donde el almidón granulado se somete posteriormente a una alfa-amilasa.

10. Proceso según la reivindicación 9, donde la alfa-amilasa es una alfa-amilasa ácida, preferiblemente derivada de un hongo, preferiblemente del género Aspergillus, especialmente Aspergillus Niger o Aspergillus oryzae.

11. Proceso según la reivindicación 8, donde el organismo de fermentación es levadura, preferiblemente Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae.

12. Proceso de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, donde el producto de fermentación es etanol, tal como etanol combustible o potable.