DOMINIOS DE UNION DE ANTIGENOS DE PECES.

Un proceso para la producción de dominio de unión a antígeno específico de antígeno utilizando un huésped transformado que contenga una secuencia DNA expresable que codifique el dominio de unión a antígeno específico de antígeno,

en donde el dominio de unión a antígeno específico de antígeno se derive de una región variable del isotipo NAR encontrado en especies de la subclase de los elasmobranquios en donde la especificidad del dominio de unión a antígeno específico de antígeno viene determinada por un antígeno que se introduce en un miembro de la subclase de los elasmobranquios

Dominios de unión de antígenos de peces.

La presente invención se refiere a la producción de dominios de unión a antígenos específicos de antígenos (anticuerpos de dominio individual) de los peces, donde el término pez abarca tanto los cartilaginosos (subclase elasmobranquios) como los peces óseos (clase osteictios). Por dominios de unión a antígenos específicos de antígenos entendemos la región variable de un Receptor de Antígeno Nuevo (NAR).

Los anticuerpos, especialmente los anticuerpos monoclonales, son útiles, entre otros, para los diagnósticos moleculares y terapéuticos debido a su alta unión, afinidad y especificidad. Sin embargo, aunque ahora resulta relativamente simple producir anticuerpos monoclonales utilizando modelos animales, sigue resultando difícil la producción de anticuerpos monoclonales humanos. Como se apreciará, cuando se introducen en humanos los anticuerpos monoclonales de modelos no humanos, el cuerpo prepara una respuesta autoinmune porque el anticuerpo monoclonal es extraño al sistema humano.

Recientemente, se ha apreciado que la actividad del anticuerpo monoclonal puede retenerse al tiempo que se reduce su rechazo en humanos al producir anticuerpos de unión individual (sda) de la cadena variable del anticuerpo correspondiente. La solicitud de patente europea número 89311731.7 presenta dichos anticuerpos de dominio individual y métodos para su producción en ratones.

Los anticuerpos de dominio individual también son importantes ya que pueden penetrar en los tejidos llevándose con ellos cualquier compuesto vinculado. Además, pueden unirse dentro de cavidades en la superficie de las proteínas, por ejemplo, dentro de centros de unión de enzimas interrumpiendo, por tanto, la función.

Los anticuerpos de dominio individual producidos de camélidos han demostrado reconocer las cavidades de las proteínas y, como tales, tienen la capacidad de inhibir enzimas (Lauwereys et al. EMBO 17 pp3512-3520 1998).

Aunque el tamaño pequeño de los anticuerpos de dominio individual producidos por camélidos ha permitido el reconocimiento de cavidades de proteínas y la inhibición de actividades de enzimas, el rango de posibles objetivos puede seguir siendo relativamente pequeño, dado que muchas cavidades de proteínas pueden seguir siendo demasiado pequeñas para ser penetrables por anticuerpos de dominio individual derivados de los camélidos.

WO94/25591 y la solicitud de patente europea número 99200439.0 hacen referencia a la producción de anticuerpos de dominio individual de anticuerpos de cadena pesada de camélidos. Los anticuerpos de dominio individual producidos por anticuerpos de cadena pesada de camélidos son más estables que los anticuerpos de cadena individual del ratón y pueden producirse en cantidades más grandes. Sin embargo, como se apreciará, incluso los miembros más pequeños de la familia de los camélidos, por ejemplo, la llama, si se mantienen en condiciones humanas, exigen zonas importantes de terreno donde poder vivir.

Diaz M et al., PNAS 24 NOV 1998, vol. 95, núm, 24, páginas 14343-14348, presenta mutaciones en las secuencias de la transmembrana NAR y las formas secretoras y sugiere que la hipermutación de NAR no genera el repertorio, sino que se implica en respuestas inmunes basadas en antígenos.

Dooley H et al., DEVELOPMENTAL & COMPARATIVE IMMUNOLOGY, vol. 24, número de Suplemento 1, 2000, páginas S37-S38 presenta NAR aislada de un tiburón nodriza sin haber sido sometido a tratamiento anteriormente y el uso de phage display para estudiar el repertorio activo funcionalmente y determinar el modo de la unión a antígenos por clones NAR individuales.

Diaz M et al., INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 11, núm. 5, 1999, páginas 825-833 analizaron 1023 mutaciones en NAR y no encontraron reconocimiento del mecanismo para ningún nucleótido concreto, pero sí obtuvieron sólidas muestras para un desvío de transición y para la polaridad de filamentos.

Krishnan U et al., THE GENOME CONFERENCE 2001 - 22ª Conferencia Anual sobre la Organización y la Expresión del Genoma, 11-15 de febrero, 2001, POSTER 1-67, Victoria, Australia, anuncia que el NAR aislado de los tiburones Wobbegong tiene características estructurales similares a las encontradas en los tiburones nodriza.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción de dominios de unión a antígeno específicos de antígenos el cual busca aliviar los problemas anteriores.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición que incluya dominios de unión a antígeno específicos de antígenos para la inhibición de la actividad de proteínas que busquen aliviar los problemas anteriores.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para la producción de un dominio de unión a antígeno específico de antígenos utilizado un huésped transformado que contenga una secuencia de DNA que pueda expresarse codificando el dominio de unión a antígeno específico de antígeno, en donde dicho dominio se derive de una región variable del isotipo de inmunogloblina NAR encontrado en una especie de la subclase de elasmobronquios en donde la especifidad del dominio de unión a antígeno específico de antígeno viene determinada por un antígeno que se introduce en un miembro de la subclase de elasmobronquios.

Se ha hallado que los dominios de unión a antígenos específicos de antígenos producidos de la región variable de NAR encontrado en peces son tan estables como los anticuerpos de dominio sencillos producidos por miembros de la familia de los camélidos.

Pueden mantenerse muchos otros peces por unidad de área que los miembros de la familia de los camélidos.

El isotipo de inmunogloblina conocido ahora como NAR (Receptor de Antígeno Nuevo), se descubrió en el suero del tiburón nodriza (Ginglymostoma cirratum) como un complejo de cadena pesada homodimérico, el cual carecía de cadenas ligeras de forma natural (Greenberg et al., Nature 374, páginas l68-173, 1995). Sin embargo, antes del trabajo actual de los inventores la identificación de NAR como dominio de unión de antígenos no se apreció completamente ni tampoco su capacidad para ser criado contra un antígeno específico.

Sólo los mamíferos (humanos, ratones, conejos, ovejas, camellos, llamas, etc.) y algunas aves (los pollos) eran considerados capaces de algo que se acercara a una segunda respuesta inmune como la maduración de afinidad, intercambio de clase de anticuerpos, etc. como respuesta a la presencia de un antígeno externo. Por ejemplo, los teleósteos (óseos), que están muchos más avanzados y evolucionados que los tiburones, parecen depender únicamente de la producción de respuesta de tipo IgM no específica de afinidad baja (Watts et al., Aust Vet J 79 pp 570-574 2001). Una característica definidora del teléosteo IgM es su baja afinidad y capacidad a los antígenos múltiples que se unen de manera no específica. La neutralización de IgM es a través de una unión múltiple no específica, que resulta principalmente en la aglutinación, etc.. La neutralización sin complemento se asocia normalmente con una unión específica de afinidad alta y que hasta esta invención no se había visto en especies de peces. Los dominios de unión a antígenos específicos de antígenos de la presente invención han demostrado neutralizar la actividad de una enzima inmunógena directamente sin pedir otros componentes del sistema inmulógico.

La región variable (v) NAR cumple con el modelo de dominios de típicas superfamilias Ig con el enlace disulfuro intradominio, canónico, predecido. Sin embargo, mientras las regiones VHH de los camélidos tiene una identidad de secuencia de hasta el 75% con otras regiones VH de los mamíferos, la identidad entre los dominios NAR V y VH convencionales es tan baja como del 25% (Roux et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, páginas 11804-11809, 1998).

Debido a esta baja identidad y a la falta de secuencias NAR en la base de datos de Kabat, los aminoácidos de las regiones NAR V han sido previamente numerados secuencialmente (Roux et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 páginas 11804-11809, 1998). Para permitir una sencilla comparación de residuos en las diferentes moléculas NAR V o secuencias en las regiones NAR V con las de otras especies durante este trabajo, se derivó un sistema de numeración...

1. Un proceso para la producción de dominio de unión a antígeno específico de antígeno utilizando un huésped transformado que contenga una secuencia DNA expresable que codifique el dominio de unión a antígeno específico de antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno específico de antígeno se derive de una región variable del isotipo NAR encontrado en especies de la subclase de los elasmobranquios en donde la especificidad del dominio de unión a antígeno específico de antígeno viene determinada por un antígeno que se introduce en un miembro de la subclase de los elasmobranquios.

2. Un proceso según la reivindicación 1 en donde el huésped transformado es una procariota o una eucariota inferior.

3. Un proceso según la reivindicación 2 en donde el huésped de la procariota es Escherichia coli.

4. Un proceso según cualquier reivindicación anterior en donde la secuencia de DNA que puede expresarse tiene la forma de un vector fagémido.

5. Un proceso según cualquier reivindicación anterior en donde la especie de la subclase de los elasmobranquios es un tiburón o un cazón.

6. Un proceso según la reivindicación 5 en donde el tiburón es un tiburón nodriza.

7. Un proceso según cualquier reivindicación anterior en donde el dominio de unión a antígeno específico del antígeno es asignado a un antígeno específico.

8. Un proceso según cualquier reivindicación anterior en donde el dominio de unión a antígeno específico del antígeno es elevado a un antígeno específico.

9. Un proceso para la producción de un dominio de unión a antígeno específico del antígeno que incluye los pasos de:

a) Inmunizar un miembro de la subclase de los elasmobranquios con un antígeno;

b) Aislar los linfocitos del miembro;

c) Aislar el RNA de los linfocitos;

d) ampliar las secuencias de DNA que codifican los dominios de unión a antígenos específicas de antígenos por PCR;

e) Clonar el DNA ampliado a un vector de visualización;

f) Transformar un huésped para producir una biblioteca;

g) Seleccionar los clones deseados de la biblioteca;

h) Aislar y purificar el dominio de unión a antígeno específico de antígenos de estos clones;

i) Clonar las secuencias de DNA codificando el dominio de unión a antígeno específico en un vector de expresión;

j) Transformar un huésped para permitir la expresión del vector de expresión.

10. Un proceso según la reivindicación 9 antes del paso d) se genera el cDNA del dominio de unión a antígeno específico del antígeno.

11. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 10 en donde las enzimas de restricción se emplean para digerir las secuencias ampliadas de DNA codificando el dominio de unión a antígeno específica del antígeno.

12. Un proceso según la reivindicación 11 en donde las enzimas de restricción son Ncol y Notl.

13. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en donde el vector de visualización es cualquier vector fagémido.

14. Un proceso según la reivindicación 13 en donde el vector de visualización es pHEN2.

15. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en donde el vector de visualización es un vector de expresión soluble.

16. Un proceso según la reivindicación 15 en donde el vector de expresión soluble es pIMSl00.