Cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un paquete comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado,

donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales, con un contenido de bacterias viables de al menos 109 unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y comprendiendo de un 0,5% a un 13% de un compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos que consisten en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de pez, maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización, y el cual además se caracteriza por el hecho de que,

al usar una cantidad del 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar el Tm'' (temperatura de iniciación de fusión a hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas, que sin el compuesto aditivo tiene un valor Tm'' de -70ºC a -46ºC, a un valor Tm'' por encima de -46ºC, tal como de -45ºC a -15ºC (medido por DSC)

y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas se caracteriza por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46 °C durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos individuales donde esto se mide mediante la siguiente prueba

los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (aproximadamente 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fin de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, puestos a aproximadamente -46ºC durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos;

con la excepción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa y donde el cultivo comprende compuesto de agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa en una cantidad de un 2% a un 13% de sacarosa medida en p/p del material congelado; y trehalosa en una cantidad de un 4% a un 6% de trehalosa medida en p/p del material congelado; y una mezcla de trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad de un 13% medido en p/p del material congelado

Cultivo de bacterias de ácido láctico de gránulos individuales.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un embalaje comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales caracterizado por el hecho de que estando almacenado a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión inicial (Tm') del cultivo, p. ej. a -46ºC, durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia permanecen sustancialmente como gránulos individuales.

Antecedentes de la invención

Hay microorganismos implicados en la producción de alimentos y productos alimenticios incluyendo la mayoría de los productos lácteos. Cultivos bacterianos, en particular cultivos de bacterias las cuales generalmente se clasifican como bacterias de ácido láctico, son esenciales en el proceso de producción de todos los productos lácteos fermentados, quesos y mantequillas. Cultivos de bacterias de este tipo pueden ser referidos como cultivos iniciadores y éstos imparten características específicas a diferentes productos lácteos mediante la realización de varias funciones.

Los cultivos lácteos iniciadores generalmente están compuestos por bacterias de ácido láctico. En el contexto presente, la expresión "bacterias de ácido láctico" (LAB) designa un grupo de bacterias Gram positivas, catalasas negativas, no móviles, que no producen esporas, microaerofílicas o anaeróbicas que fermentan azúcares con la producción de ácidos orgánicos, incluyendo ácido láctico como el ácido predominantemente producido, ácido fórmico y ácido propiónico. En el presente contexto las bacterias de ácido láctico comprenden varios géneros bacterianos dentro del filo Firmicutes. Los géneros Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosfaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oencoccus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella están reconocidos como LAB. También las bacterias Gram-positivas productoras de ácido láctico pertenecientes al filo Actinobacteria tales como los géneros Aerococcus, Microbacterium y Propionibacterium así como Bifidobacterium se consideran en el contexto presente como LAB. Las bacterias de ácido láctico más útiles a nivel industrial se encuentran entre la especie Lactococcus, la especie Streptococcus, la especie Enterococcus, la especie Lactobacillus, la especie Leuconostoc, la especie Bifidobacterium y la especie Pediococcus. Además de su uso en las bacterias de ácido láctico de la industria lechera los cultivos también tienen mucho uso en la industria del tratamiento cárnico al igual que en otras numerosas industrias.

Los cultivos iniciadores comerciales se pueden distribuir como cultivos congelados. Los cultivos congelados altamente concentrados son muy interesantes comercialmente ya que los cultivos de este tipo se pueden inocular directamente en el medio de fermentación (p. ej. leche o carne) sin transferencia intermedia. En otras palabras, tales cultivos concentrados altamente congelados comprenden bacterias en una cantidad que hace superfluos los cultivos iniciadores a granel de producción propia en los usuarios finales. Una "iniciadora a granel" se define aquí como un cultivo iniciador propagado en la planta de procesamiento de alimentos para la inoculación dentro del medio de fermentación. Los cultivos altamente concentrados se pueden referir como cultivos de fijación directa de artesa (DVS). Para comprender bacterias suficientes para usarlas como un cultivo DVS en los usuarios finales, un cultivo concentrado congelado generalmente tiene que tener un peso de al menos 50 g y un contenido de bacterias adecuadas de al menos 10⁹ unidades formadoras de colonias (CFU) por g.

Un aspecto importante en el uso práctico de cultivos congelados es la conveniencia de la manipulación real de los cultivos. Mientras que los cultivos congelados "en bloque" son difíciles de manejar se ha observado que los cultivos congelados en gránulos son muy fáciles de manejar tanto para el productor como para el consumidor.

En consecuencia, se ha formado un mercado próspero para los cultivos congelados en gránulos altamente concentrados, denominados como cultivos de fijación directa de artesa congelados (F-DVS).

Han habido varias publicaciones concernientes a la viabilidad de los cultivos congelados.

Chavarri et al. (1988) describe que la viabilidad de un cultivo de Streptococcus lactis puro congelado se puede mejorar por la adición de un 5% de lactosa o un 5% de sacarosa.

Cárcoba et al. (2000) describe que la viabilidad de un cultivo congelado puro de Lactococcus lactis subesp. lactis se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores tales como azúcares (lactosa, sacarosa y trehalosa), ácido glutámico y gelatina.

US 4.140.800 (Kline), describe que la viabilidad de los cultivos liofilizados se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores. También la viabilidad de la lactosa, sacarosa o maltosa añadidas a cultivos congelados, está discutida.

WO00/39281 (Kringelum et. al.) describe que la viabilidad de un cultivo iniciador líquido no congelado se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores, y

WO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen) describe que la viabilidad de un cultivo iniciador congelado altamente concentrado se puede mejorar por la adición de diferentes agentes crioprotectores.

Sólo WO 2004/065584 A1 describe cultivos congelados en gránulos y ninguna de las publicaciones mencionadas arriba se refiere a la estabilidad física de los cultivos congelados en gránulos durante el almacenamiento.

Resumen de la invención

Comercialmente, un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos se proporciona normalmente en un paquete adecuado (p. ej. en un envase de tetra pak de cartón de 2 l). Normalmente se almacena a una temperatura de almacenamiento de alrededor de -46ºC y el material congelado está presente en forma de gránulos individuales de un peso relativamente pequeño.

Antes de la presente invención, los inventores presentes creían que no había ningún problema significante con respecto al almacenamiento de tales cultivos de bacterias de ácido láctico (LAB) congelados en gránulos comerciales relevantes.

No obstante, en base a diferentes estudios los inventores presentes identificaron que cuando varios cultivos comercialmente relevantes donde se almacenan a aproximadamente -46ºC durante 7 días o más tiempo los gránulos individuales se pegaban entre sí y hacían aglutinaciones más grandes. En los parámetros industriales la aglutinación crea problemas de manipulación. Es p. ej. significativamente más difícil administrar una dosis adecuada del paquete del cultivo cuando el cultivo está aglutinado. Incluso puede ser difícil sacar el cultivo aglutinado del paquete de una manera conveniente.

Otros estudios identificaron que los cultivos "problemáticos" se podrían caracterizar por tener un valor Tm' (aparición de la fusión a hielo, tal y como se define por Roos (1995)) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos por debajo de la temperatura de almacenamiento de aproximadamente -46ºC. El valor Tm' es un término de la química física estándar usado en la industria alimentaria y en otros lugares. Tm' se mide rutinariamente por técnicas de Caloriometría Diferencial de Barrido (DSC) como se describe por Roos (1991). Se refiere a la temperatura inicial de fusión del producto alimenticio (aquí el cultivo de LAB congelado). Para más detalles se hace referencia a los libros de texto "Food Chemistry" (Química alimentaria) Fennema (1996) y Roos "Phase Transition in Foods" (Transición de fase en los alimentos) (1995).

Sin estar limitado a la teoría, se cree que cuando un cultivo congelado tiene un valor Tm' por debajo de su temperatura de almacenamiento, p. ej. de aproximadamente -46ºC, ocurre una transición de fase inicial (fusión) y causa que los gránulos individuales se peguen entre sí y formen aglutinaciones más grandes.

En resumen, el trabajo de los inventores presentes ha identificado hasta ahora problemas de almacenamiento no reconocidos en relación a la apariencia física de algunos tipos de cultivos...

1. Cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos en un paquete comercialmente pertinente el cual tiene un peso de al menos 50 g de material congelado, donde el material congelado está presente en forma de gránulos individuales, con un contenido de bacterias viables de al menos 10⁹ unidades formadoras de colonias (CFU) por g de material congelado y comprendiendo de un 0,5% a un 13% de un compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo que se selecciona del grupo de compuestos aditivos que consisten en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de pez, maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización, y el cual además se caracteriza por el hecho de que,

al usar una cantidad del 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado, el compuesto es capaz de aumentar el Tm' (temperatura de iniciación de fusión a hielo) del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas, que sin el compuesto aditivo tiene un valor Tm' de -70ºC a -46ºC, a un valor Tm' por encima de -46ºC, tal como de -45ºC a -15ºC (medido por DSC)

y donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congeladas se caracteriza por el hecho de que estando almacenado a aproximadamente -46 °C durante 7-14 días los gránulos individuales del cultivo congelado no se pegan entre sí y en consecuencia sustancialmente permanecen como gránulos individuales donde esto se mide mediante la siguiente prueba

los gránulos individuales del cultivo congelado son gránulos congelados en nitrógeno líquido y 100 gránulos individuales (aproximadamente 5 - 100 g de gránulos) se vierten en una placa de Petri, formando así una capa fin de gránulos únicos individuales sueltos, estando caracterizada la capa por que la mayoría de los gránulos están en contacto físico con uno o más de sus gránulos contiguos, puestos a aproximadamente -46ºC durante 7-14 días y examinados para ver si los gránulos todavía están sueltos o si los gránulos han formado aglutinaciones o están pegados entre sí donde el criterio para que los gránulos individuales del cultivo congelado permanezcan sustancialmente como gránulos individuales es que al menos 80 de los 100 gránulos individuales permanezcan como gránulos únicos individuales sueltos;

con la excepción de un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado que comprende LAB que son capaces de utilizar sacarosa y donde el cultivo comprende compuesto de agente crioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa en una cantidad de un 2% a un 13% de sacarosa medida en p/p del material congelado; y trehalosa en una cantidad de un 4% a un 6% de trehalosa medida en p/p del material congelado; y una mezcla de trehalosa/sacarosa ambas en la cantidad de un 13% medido en p/p del material congelado.

2. Cultivo congelado en gránulos según la reivindicación 1, donde el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado el cual consiste en bacterias mesofílicas que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC.

3. Cultivo congelado en gránulos según la reivindicación 1 ó 2, donde el LAB es un LAB seleccionado del grupo comprendiendo Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus acidofílus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus spp. y fúngico spp. incluyendo Pencillium, spp. Criptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. y Saccharomyces spp.

4. Cultivo congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado es un cultivo que sin comprender el compuesto aditivo según la reivindicación 1 tiene un valor Tm' de -70ºC a -46ºC.

5. Cultivo congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico congelado comprende de un 5% a un 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado.

6. Método para hacer un cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 comprendiendo las siguientes etapas:

7. Método según la reivindicación 6, donde

antes de añadir el compuesto aditivo según la etapa (i) de la reivindicación 6 uno ha medido el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado sin comprender el compuesto aditivo y ha identificado que éste tiene un valor Tm' de entre -70ºC y -46ºC; y

después de añadir el compuesto aditivo se mide el valor Tm' del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado comprendiendo el compuesto aditivo medido y se verifica que el valor Tm' sea de -49ºC a -15ºC, más preferiblemente de -39ºC a -15ºC.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7, donde el cultivo es un cultivo mesofílico mezclado que consiste en bacterias mesofílicas las cuales tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC.

9. Método según la reivindicación 6 a 8, donde el LAB es un LAB seleccionado del grupo comprendiendo Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp. incluyendo Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus acidofilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus spp. y fúngico spp. incluyendo Pencillium, spp. Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. y Saccharomyces spp.

10. Método según la reivindicación 6 a 9, donde el cultivo de bacterias de ácido láctico congeladas comprende de un 5% a un 10% del compuesto aditivo medido en p/p del material congelado.

11. Método según la reivindicación 6 a 10, donde el compuesto aditivo es un compuesto aditivo seleccionado del grupo que consiste en ciclodextrina, maltitol, trehalosa, gelatina de pez, maltodextrina, extracto de levadura y goma de pulverización.

12. Uso del cultivo de bacterias de ácido láctico (LAB) congelado en gránulos de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en un proceso para fabricar un alimento o producto alimenticio.