Método de fabricación de una planta estéril masculina que comprende (a) proporcionar una planta que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende (i) una secuencia de ADN que codifica un producto génico que,

cuando se expresa en una planta, inhibe la formación o la función del polen, y (ii) un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en (a) una secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos establecida en la figura 1 que muestra la capacidad de controlar la expresión de una secuencia de ADN en tejido de antera; (b) la secuencia de nucleótidos establecida en la figura 1; (c) una secuencia de nucleótidos que se extiende, como mínimo, 503 pares de bases en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; (d) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición -503 hasta la posición -1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; (e) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición -587 hasta la posición -1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; (f) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición -890 hasta la posición -1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; y (g) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición -503 hasta la posición -134 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; en la que dicho promotor está unido operativamente con dicha secuencia de ADN que codifica un producto génico; y (b) desarrollar dicha planta bajo condiciones de manera que se consiga la esterilidad masculina como resultado de la expresión de dicha secuencia de ADN

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El desarrollo de las plantas se puede alterar, según la presente invención, transformando una planta con una construcción genética que incluye elementos reguladores y genes estructurales capaces de actuar en forma de cascada para producir un efecto reversible en un fenotipo de planta. Una construcción adecuada incluye un promotor específico 5 de tejido, un gen dominante negativo, y una secuencia de nucleótidos que codifica un activador transcripcional unido a una proteína de unión a ADN. En particular, la presente invención se refiere a la utilización de un gen de DAM-metilasa como gen dominante negativo y un promotor específico de anteras para producir plantas transgénicas que son reversiblemente masculinas-estériles.

Existe la necesidad de un sistema genético reversible para producir plantas estériles macho, en particular para plantas 10 autógamas. La producción de semillas híbridas para su venta comercial es una industria amplia e importante. Las plantas híbridas desarrolladas a partir de semillas híbridas se benefician de los efectos heteróticos de cruzar dos líneas de cultivo genéticamente distintas. La acción agronómica comercialmente deseable del descendiente híbrido es superior a ambos padres, habitualmente en vigor, rendimiento y uniformidad. La acción óptima de las variedades de semillas híbridas en comparación con las variedades de polinización abierta hace que la semilla híbrida sea más atractiva para 15 los granjeros para plantar y, por lo tanto, generen un precio alto en el mercado.

A efectos de producir semillas híbridas no contaminadas por la propia semilla (“self seed”), se deben llevar a cabo métodos de control de polinización para asegurar la polinización cruzada y proteger contra la auto-polinización. Entre los mecanismos de control de la polinización se incluyen medios mecánicos, químicos y genéticos.

Se puede utilizar un medio mecánico para la producción de semillas híbridas si la planta de interés tiene flores 20 masculinas y femeninas espacialmente separadas o plantas macho y hembra separadas. Por ejemplo, una planta de maíz tiene flores masculinas productoras de polen en una inflorescencia en la parte superior de la planta, y las flores femeninas en la parte axial de las hojas a lo largo del pedúnculo. El cruzamiento del maíz se asegura mediante el despanojado de la hembra original para evitar la autofecundación. A pesar de que el despanojado se utiliza actualmente en la producción de semillas híbridas para plantas, tales como el maíz, el proceso es muy laborioso y costoso, ambos 25 en términos del coste de despanojado real y la pérdida de rendimiento como resultado del despanojado de la hembra original.

Sin embargo, la mayoría de las plantas de cultivo de interés tienen ambos órganos funcionales masculinos y femeninos dentro de la misma flor y, por lo tanto, la emasculación no es un proceso sencillo. Aunque es posible extraer a mano los órganos que forman el polen antes de verter el polen, esta forma de producción de híbridos es extremadamente 30 laboriosa y cara. La semilla se produce de esta manera sólo si el valor y la cantidad de semilla recuperada justifican el esfuerzo.

Un segundo medio general de producción de semillas híbridas es utilizar productos químicos que matan o bloquean la formación viable de polen. Estos productos químicos, denominados gametocidas, se utilizan para producir una esterilidad masculina transitoria. La producción comercial de semilla híbrida mediante la utilización de gametocidas está 35 limitada por el gasto y la disponibilidad de los productos químicos y la fiabilidad y longitud de acción de las aplicaciones. Una limitación seria de los gametocidas es que tienen efectos fitotóxicos, la gravedad de los cuales depende del genotipo. Entre otras limitaciones se incluyen que estos productos químicos pueden no ser eficaces para cultivos con un periodo de floración amplio porque las nuevas flores producidas pueden no estar afectadas. Consecuentemente, se requiere la aplicación repetitiva de productos químicos. 40

Muchos sistemas comerciales actuales de producción de semilla híbrida para cultivos agrícolas dependen de un medio genético de control de polinización. Las plantas que se utilizan como hembras no consiguen fabricar polen, no consiguen verter el polen o producen polen que es bioquímicamente incapaz de realizar una autofecundación. Las plantas que son incapaces de autofecundarse se dice que son “autoincompatibles” (SI). Entre las dificultades asociadas con la utilización de un sistema de auto-incompatibilidad se incluyen la disponibilidad y propagación de la línea hembra 45 auto-incompatible, y la estabilidad de la auto-incompatibilidad. En algunos casos, la auto-incompatibilidad se puede superar químicamente, o se pueden polinizar capullos inmaduros a mano antes de que se active el mecanismo bioquímico que bloquea el polen. Los sistemas auto-incompatibles que se pueden desactivar son frecuentemente muy vulnerables a las condiciones climáticas intensas que detienen o reducen la efectividad del bloqueo bioquímico a la auto-polinización. 50

Entre los sistemas que han despertado un mayor interés para la producción de semillas comerciales están los sistemas de mecanismos genéticos basados en el control del polen que provocan la esterilidad masculina. Estos sistemas son de dos tipos generales: (a) esterilidad masculina génica, que es la falta de formación del polen a causa de uno o más genes nucleares o (b) esterilidad masculina genética citoplasmática, habitualmente denominada “esterilidad masculina citoplasmática” (CMS), en la que la formación del polen es bloqueada o abortada a causa de una alteración en un 55 orgánulo citoplasmático, que generalmente es una mitocondria.

A pesar de que existen esquemas de hibridación que implican la utilización de CMS, existen limitaciones para su valor comercial. Un ejemplo de un sistema de CMS es una mutación específica en la mitocondria localizada

citoplasmáticamente que puede conducir, cuando está en el antecedente nuclear más cercano, a la falta de formación del polen maduro. En algunos casos, el antecedente nuclear puede compensar la mutación citoplasmática y tiene lugar la formación normal de polen. Los “genes restauradores” nucleares específicos permiten la formación del polen en plantas con mitocondrias con CMS. Generalmente, la utilización de CMS para la producción comercial de semillas implica la utilización de tres líneas de reproducción; una línea estéril masculina (origen hembra), una línea de 5 mantenimiento que es isogénica respecto a la línea estéril masculina, pero que contiene la mitocondria totalmente funcional, y una línea de origen masculino. La línea de origen masculino puede transportar los genes restauradores específicos y, por lo tanto, se designa habitualmente como “línea restauradora”, que transmite fertilidad a la semilla híbrida.

Para cultivos, tales como cultivos de vegetales para los que la recuperación de semillas a partir del híbrido no es 10 importante, se puede utilizar un sistema CMS sin restauración. Para cultivos en los que la fruta o la semilla del híbrido es el producto comercial, la fertilidad de la semilla híbrida se debe restaurar mediante genes restauradores específicos en el macho original o se debe polinizar el híbrido estéril masculino. La polinización de híbridos no restaurados se puede conseguir incluyendo con los híbridos un pequeño porcentaje de plantas fértiles masculinas para realizar la polinización. En la mayoría de las especies, el rasgo CMS se hereda maternalmente, ya que todos los orgánulos citoplasmáticos se 15 heredan sólo de las células del óvulo, y esto restringe la utilización del sistema.

Los sistemas CMS poseen limitaciones que los excluyen como una única solución a la producción de plantas estériles masculinas. Por ejemplo, un tipo particular de CMS en maíz (citoplasma T) confiere sensibilidad a la toxina producida por infección por un hongo particular. Aunque aún se utiliza para un conjunto de cultivos, los sistemas CMS pueden fracasar bajo ciertas condiciones del medio. 20

La esterilidad nuclear (génica) puede ser dominante o recesiva. La esterilidad dominante sólo se puede utilizar para la formación de semillas híbridas si la propagación de la línea femenina es posible (por ejemplo, a través de una propagación clonal in vitro). La esterilidad recesiva se puede utilizar si las plantas estériles y fértiles se discriminan fácilmente.... [Seguir leyendo]

1. Método de fabricación de una planta estéril masculina que comprende

(a) proporcionar una planta que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende

(i) una secuencia de ADN que codifica un producto génico que, cuando se expresa en una planta, inhibe la formación o la función del polen, y 5

(ii) un promotor que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en

(a) una secuencia de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos establecida en la figura 1 que muestra la capacidad de controlar la expresión de una secuencia de ADN en tejido de antera;

(b) la secuencia de nucleótidos establecida en la figura 1;

(c) una secuencia de nucleótidos que se extiende, como mínimo, 503 pares de bases en dirección 10 ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1;

(d) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición –503 hasta la posición –1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1;

(e) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición –587 hasta la posición –1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; 15

(f) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición –890 hasta la posición –1 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1; y

(g) una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la posición –503 hasta la posición –134 en dirección ascendente en relación con el codón de inicio en la posición de nucleótido 1488 de la figura 1;

en la que dicho promotor está unido operativamente con dicha secuencia de ADN que codifica un producto 20 génico; y

(b) desarrollar dicha planta bajo condiciones de manera que se consiga la esterilidad masculina como resultado de la expresión de dicha secuencia de ADN.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho producto génico es un gen de metilasa exógeno.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que dicho gen de metilasa exógeno es el gen de la DAM metilasa. 25

4. Construcción de ADN recombinante que comprende

(a) un operador lexA insertado en un promotor específico de tejido que está unido operativamente a un gen dominante negativo que, cuando se expresa en una planta, inhibe la formación o la función del polen, en el que el promotor específico de tejido dirige la transcripción de ADN en células o tejidos críticos con la formación o la función del polen y en el que dicho promotor específico de tejido es un promotor tal como se define en la reivindicación 1; y 30

(b) una secuencia de ADN que codifica una proteína lexA unida de manera funcional a un promotor inducible.

5. Construcción de ADN recombinante que comprende

(a) una secuencia de ADN que codifica un producto génico que, cuando se expresa en una planta, inhibe la formación o la función del polen, y

(b) un promotor, tal como se define en la reivindicación 1, que dirige la transcripción de ADN en células o tejidos 35 críticos con la formación o la función del polen que está unido operativamente con dicha secuencia de ADN que codifica dicho producto génico.

6. Construcción de ADN recombinante, según la reivindicación 5, en la que dicho producto génico es un gen de metilasa exógeno.