Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que:

X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1,

estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el resto Y;

Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y

Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo

Construcciones multiméricas.

Campo de la invención

La invención se refiere a proteínas construidas de forma recombinante útiles para tratar la neovascularización patológica, por ejemplo, asma, artritis, cáncer, y degeneración macular.

Antecedentes de la invención

La neovascularización patológica es un componente clave de enfermedades como degeneración macular relacionada con la edad (AMD) húmeda, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, osteoartritis, y asma. También desempaña un papel importante en el crecimiento y propagación de tumores. La neovascularización está regulada por un delicado equilibrio de factores pro- y anti-angiogénicos.

Se sabe que el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es necesario para la neovascularización. Se ha demostrado que la inhibición de la actividad VEGF inhibe la neovascularización en modelos animales de AMD, artritis y en diversos modelos de tumor. Los métodos usados para inhibir la actividad VEGF incluyen anticuerpos, proteínas de fusión receptoras, péptidos y pequeñas moléculas.

Se ha demostrado que las proteínas VEGF-R1 (Flt-1) y VEGF-R2 (KDR) se unen a VEGF con elevada afinidad. Tanto Flt-1 como KDR tienen siete dominios tipo Ig en su región extracelular. Se ha demostrado que el domino 2 es esencial para la unión a VEGF. Fusiones de cada uno de los receptores solubles de longitud completa (dominios 1-7) y los dominios 1-3 con Fc de IgG se unen a VEGF de forma eficaz. Las fusiones de Fc de IgG con el dominio tipo Ig 2 solo, sin embargo, eran incapaces de unirse a VEGF, ya que eran una combinación de dominio tipo Ig 1 y 2. Davis-Smyth, 1996. Por lo tanto, los dominios tipo Ig 1 y 3 parecen ser necesarios junto con el dominio 2 para la unión eficaz a VEGF.

Holash et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. vol. 99(17): 11393-11398 describe polipéptidos de fusión adicionales que comprenden partes del receptor VEGF-R1 fusionado a la parte Fc de la cadena pesada de IgG1. Vangelista et al. (2002) Protein Engineering vol. 15(1): 51-57 describe un polipéptido de fusión en el que los dos dominios extracelulares de la cadena a de FcvarepsilonRI están fusionados al dominio C-terminal de dimerización de la cadena pesada de IgG1 humana.

Breve sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusión tiene la fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.

Otro aspecto de la presente descripción es un polipéptido de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.

Otro aspecto más de la presente descripción es una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

La presente descripción también proporciona una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para multimerizar un polipéptido X. Un polipéptido X se une a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar el polipéptido XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que se forma se multimeriza.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para multimerizar un polipéptido X. El polipéptido X se une a un polipéptido Z mediante un resto Y para formar el polímero XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador que proporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que así se forma se multimeriza.

En un aspecto de la presente descripción se proporciona un ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1); un enlazador; y un dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusión comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método in vitro. Se suministra una molécula de ácido nucleico a una célula de mamífero aislada. La molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1); un enlazador; y un dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. La expresión de la proteína de fusión está controlada por un promotor. Se forma una célula que expresa una proteína de fusión.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Se suministra una célula de mamífero que expresa la proteína de fusión a un mamífero. La célula expresa y secreta la proteína de fusión suministrando de este modo la proteína de fusión al mamífero. La proteína de fusión comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

Otro aspecto de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Se suministra una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un dominio de multimerización a un mamífero. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Como alternativa, puede suministrarse una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión al mamífero, por lo cual el mamífero expresa la proteína de fusión.

Estos y otros aspectos de la presente descripción que se describirán en más detalle a continuación proporcionan a la técnica métodos y agentes para tratar enfermedades relacionadas con la proliferación e inflamación vascular. Los agentes pueden proporcionar estabilidad y biodisponibilidad aumentadas con relación a las formas naturales de las proteínas.

Ahora una parte de la descripción que está contenida en este documento proporciona los aspectos y realizaciones de la presente invención. Más particularmente, un primer aspecto de la presente invención proporciona una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el resto Y; Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos;...

1. Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que:

X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el resto Y;

Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y

Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (FLT-1).

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el polipéptido Y es flexible.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el polipéptido Y se selecciona entre el grupo compuesto por gly₉ (SEC ID Nº 27), glu₉ (SEC ID Nº 28), ser₉ (SEC ID Nº 29), gly₅cyspro₂cys (SEC ID Nº 30), (gly₄ser)₃ (SEC ID Nº 31), SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32), Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEC ID Nº 13), Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEC ID Nº 26), y Gly₉ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 34).

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que Z es una región CH3 de IgG1.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que Z es una región CH3 de IgG2.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el Fc es un Fc de IgG.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 7, en la que el Fc de IgG es Fc de IgG1.

9. Una composición que comprende la proteína de fusión de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

10. La composición de la reivindicación 9, donde dicha composición es una formulación líquida.

11. La composición de la reivindicación 9, donde dicha composición es una formulación liofilizada.

12. Una composición que comprende una o más proteínas de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde dicha composición comprende multímeros de dichas proteínas de fusión.

13. La composición de la reivindicación 12, donde dicha composición consta esencialmente de una única especie de proteína de fusión que forma homomultímeros.

14. La composición de la reivindicación 12, donde dicha composición consta esencialmente de proteínas de fusión, en las que el resto X en dichas proteínas de fusión en la composición es heterogéneo.

15. La composición de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

16. La composición de la reivindicación 15, donde dicha composición es una formulación líquida.

17. La composición de la reivindicación 15, donde dicha composición es una formulación liofilizada.

18. Un método para multimerizar un polipéptido X, comprendiendo el método:

unir un polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar el polipéptido XYZ, en el que:

X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al polipéptido Z mediante el polipéptido Y;

Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y

Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo; por lo cual el polipéptido XYZ multimeriza.

19. El método de la reivindicación 18, en el que la etapa de unión comprende construir una molécula de ácido nucleico que codifica cada uno de X, Y, y Z en forma de una única fase de lectura abierta, en el que dicho polipéptido XYZ se expresa a partir de la construcción de ácido nucleico en una célula hospedadora.

20. El método de la reivindicación 18, en el que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1).

21. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1.

22. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 21, en la que Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

23. El ácido nucleico de la reivindicación 21 ó 22, en el que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1).

24. El ácido nucleico de la reivindicación 23, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 8, 21, y 23.

25. El ácido nucleico de la reivindicación 23, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2 y 25.

26. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que X es dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 8, 21, y 23.

27. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) y la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2 y 25.

28. Una célula de mamífero que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 21-25.

29. La célula de mamífero de la reivindicación 28 que es una célula humana.

30. La célula de mamífero de la reivindicación 29 que se selecciona entre el grupo compuesto por un fibroblasto, un hepatocito, una célula endotelial, un queratinocito, una célula hematopoyética, un sinoviocito, una célula epitelial, una célula retiniana, y una célula madre.

31. Un método in vitro que comprende:

suministrar el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 21-25 a una célula de mamífero aislada para formar una célula que exprese dicha proteína de fusión.

32. El método de la reivindicación 31, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

33. El método de la reivindicación 31 ó 32 que comprende adicionalmente:

usar la célula que expresa dicha proteína de fusión para la fabricación de una composición para su suministro a un mamífero.

34. La célula de mamífero de una cualquiera de las reivindicaciones 28-30, para su uso en el tratamiento de un mamífero.

35. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 21-25, para su uso en el tratamiento de un mamífero, por lo cual dicha proteína de fusión se expresa en el mamífero.

36. El ácido nucleico de la reivindicación 35, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

37. La célula de mamífero de la reivindicación 34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o retinopatía diabética proliferativa.

38. La célula de mamífero de la reivindicación 34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero tiene cáncer.

39. La célula de mamífero de la reivindicación 34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero tiene artritis reumatoide.

40. La célula de mamífero de la reivindicación 34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero tiene asma.

41. La célula de mamífero de la reivindicación 34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero tiene osteoartritis.

42. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento de un mamífero.

43. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde el mamífero tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o retinopatía diabética proliferativa.

44. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde el mamífero tiene cáncer.

45. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde el mamífero tiene artritis reumatoide.

46. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde el mamífero tiene asma.

47. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde el mamífero tiene osteoartritis.

48. La proteína de fusión de la reivindicación 42, donde la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

49. Un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 21-25.

50. El vector de la reivindicación 49, donde el vector es un vector viral que se selecciona entre el grupo compuesto por un vector adenoviral, un vector viral adeno-asociado, un vector retroviral, y un vector lentiviral.

51. El vector de la reivindicación 50, donde el vector es un vector viral adeno-asociado.

52. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 49-51, para su uso en el tratamiento de un mamífero.

53. El vector de la reivindicación 52, donde el mamífero tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o retinopatía diabética proliferativa.

54. El vector de la reivindicación 52, donde el mamífero tiene cáncer.

55. El vector de la reivindicación 52, donde el mamífero tiene artritis reumatoide.

56. El vector de la reivindicación 52, donde el mamífero tiene asma.

57. El vector de la reivindicación 52, donde el mamífero tiene osteoartritis.