Compuesto para el etiquetado de biomoléculas basado en vinilsulfona,

preparación y usos.

Compuestos que comprenden una molécula etiqueta y un grupo vinilsulfona. Además, se refiere al uso de los compuestos como agentes de etiquetado, al procedimiento de obtención de los mismos y sus usos en el marcaje de biomoléculas, y más concretamente de proteínas

Compuesto para el etiquetado de biomoléculas basado en vinilsulfona, preparación y usos.

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) que contiene una molécula etiqueta y un grupo vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo la unión covalente a las moléculas susceptibles de etiquetado. La presente invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos compuestos, conteniendo un fluoróforo, para el etiquetado de biomoléculas y a sus aplicaciones biotecnológicas.

Estado de la técnica anterior

El etiquetado de biomoléculas es una herramienta básica en el campo de la genómica y la proteómica para la detección, purificación y estudio de interacciones entre biomoléculas.

De entre la gama de etiquetados de biomoléculas que son plausibles, destacan por su especial importancia los etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones biotecnológicas y su impacto comercial.

El etiquetado fluorescente es un elemento clave para la detección y análisis de biomoléculas (Patton, W.F. Electrophoresis (2000), vol. 21, pp. 1123-1144) y es el motor de una industria de miles de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente, frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie, la plata, el oro coloidal o la radioactividad son las siguientes:

- Detección rápida y de sensibilidad elevada: cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de 10⁷-10⁸ fotones por segundo.

- Versatilidad: Distintos etiquetados originan distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado "policromático" como el empleado, por ejemplo, en la secuenciación de ADN (Smith, L., et al., Nature (1986), vol. 321, pp. 674-679).

- Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo raramente interfieren con la biomolécula marcada.

- Localización de la señal en el punto de etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.

Sin embargo, su potencial va más allá de la detección pasiva dado que técnicas como la polarización de fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, también denominado Forster Resonance Energy Transfer) permiten evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o entre proteína y ligando. La medida de la polarización proporciona información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar las interacciones receptor-ligando (Jameson, D.M., Seifried, S.E., Methods (1999), vol. 19, pp. 222-233). FRET es una interacción entre fluoróforos en la cual la excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a otro que se excita (aceptor) sin la emisión de un fotón. Esta interacción se produce cuando la longitud de onda de emisión del donante es muy próxima a la de excitación del aceptor y es muy dependiente de la distancia entre donante y aceptor, por lo que se ha empleado como regla (Remedios, C.G., Moens, P.D., J. Struct. Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185) para analizar cambios conformacionales e interacción entre biomoléculas.

Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus aplicaciones se resumen en la tabla adjunta:

Por otro lado, el etiquetado con biotina también tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A., Anal. Biochem. (1988), vol. 171, pp. 1-32). La biotina es una molécula que actúa como coenzima de determinadas carboxilasas relacionadas con el metabolismo del dióxido de carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica en la alta especificidad y afinidad que la avidina, estreptavidina y otras proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula (constante de disociación del orden de 10^-15 M^-1), haciendo que la interacción tenga la fortaleza de un enlace covalente sin serlo. Así, la biotinilización transforma moléculas difícilmente detectables en sondas que pueden ser detectadas o capturadas con avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este principio es común para localizar antígenos en tejidos, células y para detectar biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de hibridación de ADN. Sin embargo, para determinadas aplicaciones, como por ejemplo la purificación mediante cromatografía de afinidad, se necesita que la interacción biotina-avidina sea reversible, para lo cual se puede modificar tanto la avidina (por nitrosación de las tirosinas del centro activo (Morag, E., et al., Biochem. J. (1996), vol. 316, pp. 193-199) como usar derivados de biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen biotinas marcadas fluorescentemente para cuantificar los sitios activos de la avidina (Gruber, H. J, et al., Biochim. Biophys. Acta (1998), vol. 1381, pp. 203-212) y biotina etiquetada con DNP (DNP-X-biocytin-X, US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos anti-DNP, permitiendo la correlación entre fluorescencia y estudios de microscopia electrónica. Existe también en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con biotina.

Un aspecto fundamental de cara al uso de cualquier etiquetado es la unión a la biomolécula y la estabilidad de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado convenientemente derivatizados a través de la formación de un enlace covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos carboxílicos, que a continuación se detallan:

Aminas: Son la diana más común de los reactivos de modificación covalente y la principal en proteínas. En la mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena lateral hay un grupo varepsilon-amino fácilmente modificable dado que se localiza mayoritariamente en la superficie de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y la reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como la de la cadena lateral de la lisina, son moderadamente básicas y reaccionan con la mayoría de los reactivos acilantes a pH superior a 8.

Tres son las derivatizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con las aminas de las biomoléculas:

- Succinimidil ésteres. Reaccionan con aminas para originar amidas. Es la derivatización más frecuente dada la estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazoles (histidina). En presencia de tioles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina. Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil ésteres es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que pueden convertirse en sulfosuccinimidil ésteres (Staros, J.V., et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp. 220-222) o STP ésteres (Gee, K.R., et al., Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp. 1471-1474), que son más polares, y por ello más solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco expuestas.

- Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en la mayoría de los casos.

- Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que reaccionen con las aminas alifáticas, por lo que se trabaja a baja temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles (histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir desplazamientos nucleofílicos.

- Otras funcionalizaciones...

1. Compuesto de fórmula general (I):

donde:

X es oxígeno (O), azufre (S), ó el grupo NR, donde

R es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre un grupo alquilo (C₁-C₁₀), hidroxialquilo o un grupo (CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OH;

donde n toma valores de entre 2 y 20;

R¹ es un grupo alquilo (C₁-C₁₀), sustituido o no sustituido,

Y no existe o es un grupo -SO₂R², donde

R² es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre los grupos: -CH₂CH₂OR³OCH₂CH₂, ó -(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂, donde:

R³ es un radical, sustituido o no sustituido, que se selecciona de entre los grupos alquilo (C₁-C₁₀) ó dialquilarilo ((C₁-C₁₀)Ar(C₁-C₁₀)); y

m toma valores de entre 2 y 20; y

representa una molécula etiqueta.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde la molécula etiqueta es un fluoróforo.

3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el fluoróforo es dansilo.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R¹ es un grupo etilo (CH₂CH₂).

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Y es un grupo -SO₂R², con la siguiente fórmula general (II):

donde: R¹, X y R² están definidos en la reivindicación 1.

6. Compuesto según la reivindicación 5, donde R² es (CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂, y m está descrito en la reivindicación 1.

7. Compuesto según la reivindicación 6, donde m toma valores de 2 a 6.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde Y no existe, con la siguiente fórmula general (III),

donde: R¹ y X están definidos en la reivindicación 1.

9. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

donde m toma valores 2 ó 5.

10. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

donde m toma valores 2 ó 5.

11. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:

12. Método de obtención del compuesto de fórmula general (I) que comprende la reacción de:

a) una vinilsulfona de fórmula general (IV):

donde Y esta definido en la reivindicación 1

b) con una molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados funcionalizados, según la fórmula general (V):

donde: X y R' están definidos en la reivindicación 1.

13. Método según la reivindicación 12, donde la vinilsulfona del paso (a) se selecciona de entre los compuestos de fórmula:

14. Método según la reivindicación 12, donde la molécula etiqueta del paso (b) se selecciona de entre los compuestos de fórmula:

15. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, como agente de etiquetado.

16. Agente de etiquetado que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

17. Uso del agente de etiquetado según la reivindicación 16, para el marcaje de biomoléculas.

18. Uso del agente de etiquetado según la reivindicación 17, donde las biomoléculas son proteínas.