COMPOSICION FARMACEUTICA PARA INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNE EN UN SER HUMANO O ANIMAL.

Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un ser humano o un animal,

que comprende células dendríticas que presentan una multiplicidad de antígenos de cáncer/testículo, caracterizada por

a) que las células dendríticas presentan al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje, proporcionándose dichos antígenos por al menos una línea celular de cáncer que expresa al menos cinco antígenos de cáncer/testículo diferentes y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje, significando esto que en un ensayo de citotoxicidad de 4 horas en presencia de antígenos de diferenciación de melanocitos/con especificidad de linaje dichas células experimentan menos de 10% de lisis

b) que las células dendríticas se han cultivado ex vivo en medio de crecimiento sin ninguna citocina en una fase de crecimiento inicial, seguida de una segunda fase de crecimiento en medio que comprende citocinas antes de cargar las células dendríticas con los antígenos de cáncer/testículo,

c) que las células dendríticas son inmaduras, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 durante la carga de los antígenos de cáncer/testículo, y

d) que las células dendríticas se han madurado por la adición de factores de maduración después de la carga de los antígenos

Composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un ser humano o animal.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un ser humano o un animal. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener células dendríticas autólogas cargadas con al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y sin antígeno de diferenciación con especificidad de linaje o sustancialmente sin antígeno de diferenciación con especificidad de linaje. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una línea celular de melanoma aislada. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de la composición como una vacuna inmunoterapéutica y al uso de células dendríticas autólogas como células presentadoras de antígeno en una composición farmacéutica o una vacuna. En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir un medicamento que induce una respuesta inmune en un ser humano o en un animal.

Técnica antecedente

Los cánceres avanzados representan una de las causas principales de muerte en los seres humanos. Hasta ahora no se ha sugerido ningún método de tratamiento eficaz. La inmunoterapia para el cáncer pretende destruir las células tumorales por mecanismos inmunológicos. La inmunoterapia, en comparación con métodos convencionales de terapia para el cáncer tales como la cirugía, la radiación y la quimioterapia, es mucho menos tóxica y hasta la fecha no se han descrito complicaciones graves. Además, la inmunoterapia puede actuar en diferentes estadios de la enfermedad. En los estadios iniciales podría ser un buen tratamiento complementario a la eliminación quirúrgica de tumores primarios, con el objetivo de impedir el desarrollo de la enfermedad diseminada. En estadios avanzados de la enfermedad podría ser el único medio de tratamiento, ya que los métodos convencionales con frecuencia son ineficaces.

La función principal del sistema inmune es identificar y destruir sustancias extrañas (antígenos) que invaden el organismo. El sistema inmune puede discriminar lo "propio" de lo "ajeno" y en condiciones normales sólo desarrollar una respuesta inmune contra antígenos extraños o "ajenos". Aunque las células cancerosas proceden de las propias células de los organismos, se tratan como extrañas por el sistema inmune natural. Sin embargo, esta respuesta inmune natural no es suficientemente fuerte para bloquear la aparición y el crecimiento del tumor. La tarea de la inmunoterapia es aumentar la capacidad del sistema inmune de reconocer células tumorales y desarrollar mecanismos eficaces de eliminación de tumores. Las dos cuestiones principales en cualquier inmunoterapia específica son a qué antígenos dirigirse y encontrar la presentación óptima del antígeno al sistema inmune.

Los antígenos asociados a tumores (TAA) reconocidos por los linfocitos T citotóxicos (CTL) son el componente más eficaz para establecerse como diana entre los mecanismos efectores conocidos en la inmunidad antitumoral. Hay dos tipos principales de TAA: antígenos únicos, presentes sólo en unos pocos tumores y por lo tanto no útiles como dianas generales, y TAA compartidos o comunes, presentes en muchos tumores. Actualmente se están considerando tres grupos principales de antígenos compartidos como posibles dianas para la inmunoterapia y se ha demostrado que todos ellos inducen la generación de linfocitos T citotóxicos. Los tres grupos son: antígenos de cáncer/testículo (antígenos CT), antígenos expresados en exceso en tumores y antígenos de diferenciación con especificidad de linaje.

Los antígenos CT se codifican por genes específicos de la línea germinal o de una línea cancerosa, representando uno de los grupos más grandes de antígenos asociados a tumores compartidos. Los antígenos CT se descubrieron originalmente en melanomas, pero también se han encontrado en muchas otras malignidades humanas. Entre los tejidos normales sólo se expresan en testículo y en algunos casos en placenta. Las células normales que expresan estos antígenos no pueden expresar moléculas del MHC y, por lo tanto, estos antígenos normalmente no están accesibles para el reconocimiento por los linfocitos T.

Esto hace que los antígenos CT sean dianas muy atractivas para una inmunoterapia específica para cánceres.

Ciertos ensayos clínicos recientes han demostrado regresión tumoral en un número significativo de melanomas y pacientes con cáncer de vejiga mediante el establecimiento como diana de un antígeno CT específico ((Ni-shiyama et al., 2001, Clin. Cancer Res., v. 7, págs. 23-31; Thurner et al., 1999, J. Exp. Med., v. 190, págs. 1669-1678)). Sólo se ha notificado reconocimiento de antígenos CT por las células T para algunos antígenos CT y se han determinado los epítopos de péptidos correspondientes. Sin embargo, todos los antígenos CT podrían considerarse posibles dianas para inmunoterapia. Se ha encontrado una correlación de la expresión de antígenos MAGE-A y progresión tumoral en varias malignidades ((Brasseur et al., 1995, Int. J. Cancer, v. 63, págs. 375-380; Eura et al., 1995, Int. J. Cancer, v. 64, págs. 304-308; Katano et al., 1997, J. Surg. Oncol., v. 64, págs. 195-201; Patard et al., 1995, Int. J. Cancer, v. 64, págs. 60-64)). Otro grupo de antígenos CT, los antígenos MAGE-B, muestran una expresión específica de tumor significativamente menor que los antígenos MAGE-A. Un tercer grupo, los antígenos MAGE-C, presentan un patrón de expresión que se parece al patrón de los antígenos MAGE-A. Aún no se ha notificado ninguna respuesta de CTL contra los antígenos MAGE-C.

Se han descrito varias proteínas no pertenecientes al grupo MAGE con las características de los antígenos CT. Una de ellas, NY-ESO-1, es uno de los antígenos tumorales más inmunogénicos identificados hasta la fecha. Ciertos ensayos clínicos con inmunización con péptidos de pacientes con melanoma demostraron la estabilización de la enfermedad y la regresión de algunas metástasis en algunos pacientes ((Jäger et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, v. 97, págs. 12198-12203)).

A diferencia de los antígenos CT, los antígenos expresados en exceso en tumores carecen absolutamente de expresión con especificidad tumoral, ya que su expresión podría detectarse a bajos niveles en algunos tipos de tejidos normales distintos del testículo. El desarrollo de inmunoterapia para algunos de estos antígenos podría ser beneficioso para pacientes con cáncer, y actualmente estos antígenos, tales como CEA, p53, HER-2/Neu, MUC-1 y alfa-fetoproteína se están investigando intensivamente como posibles dianas en ensayos clínicos. El grupo de antígenos tumorales expresados en exceso sólo se ha usado recientemente como dianas en ensayos clínicos, y por lo tanto no se dispone de datos sobre la eficacia de la inducción de respuestas inmunes terapéuticas.

Los antígenos con especificidad de linaje, los antígenos de diferenciación de melanocitos y los antígenos asociados con la próstata, hasta ahora sólo se han descrito para dos tipos de cánceres humanos: melanomas y cáncer de próstata. Este grupo de antígenos se expresa tanto en tejido normal diferenciado como en dos tipos de cánceres humanos. En tejido normal diferenciado estos antígenos muy rara vez inducen una respuesta inmune, sin embargo, estas proteínas se vuelven inmunogénicas en células cancerosas y en el caso de los melanomas es posible detectar células T destructoras que reaccionan con antígenos de diferenciación de melanocitos. Un número importante de ensayos clínicos dirigidos contra melanomas o cáncer de próstata emplean el establecimiento como diana de antígenos de diferenciación.

Entre los grupos de antígenos asociados a tumores se obtuvieron los datos más prometedores usando TAA como dianas para la inmunoterapia con algunas de las proteínas MAGE. Sin embargo, especialmente en el caso de los melanomas, el efecto terapéutico era inestable y algunas metástasis continuaron creciendo. Estas metástasis normalmente eran negativas para la expresión de los antígenos MAGE usados para la inmunización ((Thurner et al., 1999, J. Exp. Med., v. 190, págs. 1669-1678)).

Una posibilidad para inducir una respuesta inmune polivalente es emplear células tumorales enteras o material procedente de células enteras. Los documentos WO 9003183, US 5.840.317 y US 6.187.306 describen varias preparaciones de vacunas basadas en células de melanoma. El documento US 4.108.983 describe una vacuna de melanoma de primera generación...

1. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un ser humano o un animal, que comprende células dendríticas que presentan una multiplicidad de antígenos de cáncer/testículo, caracterizada por

        a)        que las células dendríticas presentan al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje, proporcionándose dichos antígenos por al menos una línea celular de cáncer que expresa al menos cinco antígenos de cáncer/testículo diferentes y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje, significando esto que en un ensayo de citotoxicidad de 4 horas en presencia de antígenos de diferenciación de melanocitos/con especificidad de linaje dichas células experimentan menos de 10% de lisis

        b)        que las células dendríticas se han cultivado ex vivo en medio de crecimiento sin ninguna citocina en una fase de crecimiento inicial, seguida de una segunda fase de crecimiento en medio que comprende citocinas antes de cargar las células dendríticas con los antígenos de cáncer/testículo,

        c)        que las células dendríticas son inmaduras, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 durante la carga de los antígenos de cáncer/testículo, y

        d)        que las células dendríticas se han madurado por la adición de factores de maduración después de la carga de los antígenos.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las células dendríticas son células dendríticas autólogas.

3. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que se usa un lisado de células enteras de al menos una línea celular de cáncer que no expresa ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje como se define en la reivindicación 1, para cargar las células dendríticas.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la presentación de dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo en las células dendríticas se realiza por fusión de células enteras.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la presentación de dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo se realiza por medio del uso de exosomas.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la línea celular de cáncer es una línea celular de melanoma y los antígenos de diferenciación con especificidad de linaje son antígenos de diferenciación de melanocitos.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que los antígenos de diferenciación de melanocitos comprenden gp100, Melan A/Mart-1 y tirosinasa.

8. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que se proporcionan precursores de células dendríticas en forma de monocitos a partir de sangre periférica del ser humano o el animal.

9. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que se proporcionan precursores de células dendríticas procedentes de médula ósea del ser humano o animal.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que como fuente de células dendríticas o monocitos no está implicado ningún producto de leucoféresis.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que las células dendríticas proceden de monocitos CD14+.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1-9, en la que las células dendríticas proceden de células CD34+.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre las subfamilias MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, GAGE, LAGE, SSX.

14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, NY-ESO-1, LAGE, PAGE-1, PAGE-2, PAGE-3, PAGE-4, XAGE-1, XAGE-2, XAGE-3, SSX-1, SSX-2, SSX-3, SSX-4 y SSX-5.

15. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre SCP-1, TSP-50, TRAG-3, SAGE, IL-13R alfa y CTp11.

16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 16, en la que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12 y NY-ESO-1.

17. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo se proporcionan a partir de al menos dos líneas celulares de melanoma alogénicas.

18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 17, en la que las líneas celulares de melanoma alogénicas se seleccionan entre DDM-1.7 que puede obtenerse a partir de la línea celular depositada ECACC 01112339 o DDM-1.13 que puede obtenerse a partir de la línea celular depositada ECACC 01112338.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-18, en la que la expresión de dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo en dicha al menos una línea celular de cáncer se aumenta adicionalmente por desmetilación del ADN antes de proporcionar el lisado de células enteras de dicha al menos una línea celular de cáncer.

20. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, en la que dicha desmetilación se proporciona por tratamiento con 5-aza-2'-desoxicitidina.

21. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las citocinas se seleccionan entre el grupo que comprende IL-4, GM-CSF, IL-13, IFN-?, FIt-31, SCF y TNF-a.

22. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21, en la que las citocinas comprenden IL-4 y GM-CSF.

23. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la fase de crecimiento inicial es de 6 a 48 horas, particularmente de 12 a 34 horas y más particularmente de 20 a 28 horas.

24. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en la que los factores de maduración comprenden IL-1ß, IL-6, TNF-a y PGE2.

25. Un método para obtener células dendríticas autólogas humanas o animales cargadas con al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje, que comprende las etapas:

        a)        cultivar células dendríticas inmaduras autólogas, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 obtenidas a partir de dicho ser humano o animal ex vivo en medio de crecimiento sin ninguna citocina en una fase de crecimiento inicial, seguida de una segunda fase de crecimiento en medio que comprende citocinas, y

        b)        cargar dichas células dendríticas inmaduras autólogas, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 de a) con los antígenos de cáncer/testículo obtenidos a partir de un lisado de células enteras de dicha al menos una línea celular de cáncer que expresa al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje como se define en la reivindicación 1, y

        c)        conseguir la maduración de las células dendríticas cargadas de b) por la adición de factores de maduración.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que en la etapa c) se usa una densidad de siembra de monocitos comprendida entre 5 x 10⁶ y 20 x 10⁶ células por 25 cm².

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26, en el que las células dendríticas autólogas se proporcionan a partir de sangre recién extraída.

28. Una línea celular de melanoma aislada que expresa al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación de melanocitos como se define en la reivindicación 1, seleccionada entre el grupo consistente en DDM-1.7 que se puede obtener a partir de las líneas celulares depositadas ECACC 01112339 o DDM-1.14 que se puede obtenerse a partir de las líneas celulares depositadas ECACC 01112338.

29. Exosomas derivados de una línea celular aislada de acuerdo con la reivindicación 28.

30. Un uso de células dendríticas como células presentadoras de antígeno en una composición farmacéutica o una vacuna, y donde dichas células dendríticas están cargadas con al menos cinco antígenos de cáncer/testículo diferentes y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje como se define en la reivindicación 1 en su estado inmaduro, momento en el que las células dendríticas son positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83, donde las células dendríticas se han cultivado ex vivo en medio de crecimiento sin ninguna citocina en una fase de crecimiento inicial, seguida de una segunda fase de crecimiento en medio que comprende citocinas antes de cargar la célula dendrítica con dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y donde las células dendrítica se han hecho madurar por la adición de factores de maduración después de la carga de los antígenos.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, donde las células dendríticas son células dendríticas autólogas.

32. El uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que las células dendríticas autólogas se proporcionan a partir de sangre recién extraída.

33. El uso de al menos cinco antígenos de cáncer/testículo obtenidos a partir de una línea celular de cáncer aislada de la reivindicación 28 en una composición farmacéutica o formulación de vacuna.

34. El uso de las líneas celulares aisladas DDM-1.7 que puede obtenerse a partir de la línea celular depositada ECACC 01112339 o DDM-1.13 que puede obtenerse a partir de la línea celular depositada ECACC 01112338, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cánceres.

35. Un método para producir un medicamento para inducir una respuesta inmune en un ser humano o animal, que comprende las etapas de:

        a)        cultivar células dendríticas inmaduras autólogas, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 obtenidas a partir de dicho ser humano o animal ex vivo en medio de crecimiento sin ninguna citocina en una fase de crecimiento inicial, seguida de una segunda fase de crecimiento en medio que comprende citocinas, y

        b)        cargar dichas células dendríticas inmaduras autólogas, positivas para CD1a, negativas para CD14 y negativas para CD83 de a) con los antígenos de cáncer/testículo obtenidos a partir de un lisado de células enteras de dicha al menos una línea celular de cáncer que expresa al menos cinco antígenos de cáncer/testículo y ningún antígeno de diferenciación con especificidad de linaje como se define en la reivindicación 1, y

        c)        madurar dichas células dendríticas cargadas procedentes de b) por la adición de factores de maduración después de la carga de los antígenos.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en el que las células dendríticas después de la carga con los antígenos de cáncer/testículo se hacen madurar por la adición de factores de maduración que comprenden IL-1ß, IL-6, TNF-a y PGE2.

37. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-36, en el que dicha al menos una línea celular de cáncer es una línea celular de melanoma y los antígenos de diferenciación con especificidad de linaje son antígenos de diferenciación de melanocitos.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en el que los antígenos de diferenciación de melanocitos comprenden gp100, Melan A/Mart-1 y tirosinasa.

39. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-38, en el que las células dendríticas autólogas se proporcionan a partir de sangre periférica del ser humano o animal.

40. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-39, en el que las células dendríticas autólogas se proporcionan a partir de la médula ósea del ser humano o animal.

41. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en el que las células dendríticas autólogas proceden de monocitos CD14+.

42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 ó 40, en el que las células dendríticas autólogas proceden de células CD34+.

43. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-42, en el que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre las subfamilias MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, GAGE, LAGE y SSX.

44. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-43, en el que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, NY-ESO-1, LAGE, PAGE-1, PAGE-2, PAGE-3, PAGE-4, XAGE-1, XAGE-2, XAGE-3, SSX-1, SSX-2, SSX-3, SSX-4 y SSX-5.

45. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-42, en el que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre SCP-1, TSP-50, TRAG-3, SAGE, IL-13R alfa y CTp11.

46. El método de acuerdo con la reivindicación 44, en el que los antígenos de cáncer/testículo comprenden antígenos seleccionados entre MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12 y NY- ESO-1.

47. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-46, en el que la expresión de dichos al menos cinco antígenos de cáncer/testículo en dicha al menos una línea celular de cáncer se aumenta adicionalmente por desmetilación de ADN antes de la lisis.

48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en el que dicha desmetilación se proporciona por tratamiento con 5-aza-2'-desoxicitidina.

49. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-48, en el que dichas al menos dos líneas celulares de cáncer alogénicas se proporcionan en la etapa a).

50. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-49, en el que las líneas celulares de melanoma alogénicas se seleccionan entre DDM-1.7 que se puede obtener a partir de la línea celular depositada ECACC 01112339 o DDM-1.13 que se puede obtener a partir de la línea celular depositada ECACC 01112338.

51. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-50, en el que las citocinas se seleccionan entre el grupo que comprende IL-4, GM-CSF, IL-13, IFN-?, FIt-31, SCF y TNF-a.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 51, en el que las citocinas comprenden IL-4 y GM-CSF.

53. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 35-52, en el que la fase de crecimiento inicial es de 6 a 48 horas, particularmente de 12 a 34 horas y más particularmente de 20 ó 28 horas.

54. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35-53, en el que las células dendríticas inmaduras autólogas de la etapa a) se obtienen a partir de un ser humano o animal al que previamente se le ha administrado una sustancia que comprende G-CSF y/o GM-CSF.