Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae CECT 11783 modificada genéticamente capaz de expresar y escretar en,

cantidades comercialmente útiles una endopoligalacturonasa, para su empleo en la industria de alimentos y bebidas. Para lograr este objetivo, se incluyó en el genoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae el fragmento lineal de DNA de secuencia definida con el gen que codifica para la endopoligalacturonasa (PGU1) unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) ambos de origen Saccharomyces cerevisiae, desprovistos de secuencias bacterianas o de cualquier otro organismo distinto al citado.

Esta cepa puede ser empleada para sintetizar la enzima y posteriormente purificarla y adicionarla a los zumos de frutas para mejorar la clarificación y el rendimiento en la extracción, o bien, como ocurre en los productos fermentados, que la levadura produzca la enzima directamente durante el proceso, sin necesidad de ser adicionada al medio

Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae CECT 11783, modificada genéticamente con actividad pectinolítica: su método de obtención y aplicación.

Sectores de la técnica

Técnicas de ingeniería genética. Fabricación de alimentos y bebidas. Levaduras vínicas.

Estado de la técnica

Las pectinas son heteropolisacáridos, y los principales constituyentes de la lámina media y pared primaria celular de las plantas superiores. Son las responsables de la integridad y coherencia de los tejidos vegetales y además de su función como agentes lubricantes y cementantes, están involucradas en las interacciones entre la planta el ataque de patógenos (Van Rensburg y Pretorious, 2000).

En la industria alimentaria, las pectinas pueden originar problemas, durante la extracción, filtración y clarificación de los zumos de frutas, por la turbidez y viscosidad que comunican a los mismos.

En vinificación se utilizan las pectinasas para mejorar los rendimientos de extracción de mosto por degradación de los polisacáridos estructurales que interfieren en la extracción (Sims et al., 1988), para aumentar la liberación de compuestos del color y del aroma en los mostos antes y durante la fermentación y la maceración, así como, para facilitar la clarificación y filtración de los vinos (Villetaz, 1990, 1996 y Servili et al., 1992).

Las enzimas pectinolíticas se encuentran principalmente en los mohos y en las bacterias, pero también están presentes en algunas levaduras. Debido al papel desempeñado por las levaduras, especialmente del género Saccharomyces, en los productos fermentados, es interesante profundizar en el estudio de sus enzimas pectinolíticas con dos objetivos: o bien utilizar la levadura para sintetizar las enzimas y posteriormente purificarlas y adicionarlas a los zumos de frutas para favorecer así la clarificación y la extracción o bien, como ocurre en los productos fermentados, que la levadura produzca la enzima directamente durante el proceso, sin necesidad de ser adicionada al medio.

La mayoría de los preparados comerciales de pectinasas usados en la industria de los alimentos, proceden de Aspergillus Níger, que además de producir grandes cantidades de estas enzimas es considerado un microorganismo GRAS (Generaly Recognized as Safe). Sin embargo este moho secreta, otras menos deseables en la producción de vino o de zumos de frutas, como por ejemplo la arabinofuranosidasa que puede causar turbidez (Whitaker, 1984).

La capacidad de S. cerevisiae para degradar el ácido poligalacturónico podría tener importantes consecuencias en la fermentación de sustratos derivados de plantas ya que se han encontrado cepas que poseen la capacidad para degradarlo (Mc Kay. 1990). Gainvors et al. (1994a) encontraron que la cepa SCPP, recientemente identificada como S. bayanus, (Naumov et al. 2001) producía tres tipos de enzimas pectinolíticos, pectin metil esterasa, pectin liasa y poligalacturonasa y además demostraron (Gainvors et al., 1994b) que cuando a un mosto fresco se le adicionaba el extracto enzimático de dicha cepa, se obtenían los mismos resultados sobre la turbidez, que cuando se añadía una preparación enzimática comercial (Endozyme ®).

Blanco et al. (1997) observaron que al vinificar con cepas S. cerevisiae PG+, en algunos casos se reducía el tiempo de filtración en un 50% aproximadamente, sin obtener cambios apreciables en la viscosidad.

Probablemente el principal problema de utilizar enzimas pectinolíticas de levaduras en el procesado industrial, reside en los bajos rendimientos de actividad en la fermentación; por lo que una alternativa sería clonar y sobreexpresar los genes estructurales responsables de estas actividades enzimáticas, obteniendo así una cepa de levadura vínica que facilitara la clarificación del mosto y del vino durante la fermentación con la consiguiente ventaja económica. Estas cepas podrían además incrementar el color y el aroma de los vinos (Van Rensburg y Pretorious, 2000).

La presente invención se refiere a la transformación de la cepa vínica UCLMS-1 con buenas cualidades enológicas con el gen PGU1 procedente de la cepa UCLMS-29, unida en fusión transcripcional al promotor del gen PGK1 con el fin de incrementar su expresión durante el proceso de vinificación. La primera referencia a este promotor fue publicada en 1987 (Clive Stanway et al. "The UAS of the yeast PGK gene contains functionally distinct domains". Nucleic Acids Research. Volume 15, number 17, 1987) y su secuencia de nucleótidos, que está localizada en el cromosoma III de Saccharomyces cerevisiae (NC_001135), fue publicada el 24 de abril de 1996 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=85666111; range from 137164-137743); (http: //www.yeastgenome.org/archive/sequence_done.shtml).

Se realizaron ensayos de microvinificación tanto en mosto blanco como en tinto, con la cepa transformadora CECT 11783, y con la misma cepa sin transformar, comparándose los resultados obtenidos.

Breve descripción de la figura

Figura 1. Esquema de la transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae (UCLMS-1) con actividad endopoligalacturonasa.

Explicación de la invención

La presente invención se relaciona con la rama de la Biotecnología y la Ingeniería Genética, y en particular con una nueva cepa de levadura modificada genéticamente productora de una endopoligalacturonasa, así como con el procedimiento para su obtención.

El objetivo técnico que persigue la misma es la obtención de una cepa de levadura capaz de expresar y excretar en cantidades comercialmente útiles esta enzima con actividad pectinolítica, para su empleo en la industria de alimentos y bebidas.

Para lograr este objetivo se incluyó en el genoma de la cepa de Saccharomyces cerevisiae UCLMS-1 con buenas propiedades enológicas el gen que codifica para la endopoligalacturonasa (PGU1) (SEQ ID NO 1) unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) (PGK1p) (SEQ ID NO 2) proveniente de la cepa Saccharomyces cerevisiae UCLMS-39, obteniéndose una cepa hiperproductora de la enzima durante el proceso de fermentación, mejorando considerablemente el rendimiento de extracción de mosto/zumo a partir de la materia prima. Esta cepa ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con la referencia CECT 11783, con sede en la Universidad de Valencia, la que ostenta la categoría de Autoridad de Depósito autorizada según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.

Modo de realización de la invención

La invención consiste en el desarrollo de una cepa de Saccharomyces cerevisiae con buenas propiedades enológicas, capaz de producir pectinasas durante la fermentación alcohólica. Para ello se seleccionó una cepa de Saccharomyces cerevisiae con actividad endopoligalacturonásica, cuyo gen PGU1 (SEQ ID NO 1) era funcional bajo su propio promotor y bajo el promotor GAL1, y con el fin de incrementar sus niveles de expresión, en condiciones fermentativas, se sustituyó el promotor nativo del gen PGU1 (SEQ ID NO 1) por el promotor de expresión fuerte del gen PGK1 (3-fosfoglicerato quinasa) (PGK1p) (SEQ ID NO 2) de S. cerevisiae. Su secuencia contenía una mutación en el nucleótido 877 (ArightarrowG) que le confería el cambio de un aminoácido (Ser 293rightarrowGly) de los 361 que constituían la proteína, comparada con la encontrada en la base de datos para la cepa S288C (correspondiente a ORF YJR 153W, localizada en el cromosoma X).

En una primera reacción de amplificación (PCR1), se amplificó un fragmento de DNA que portaba el promotor del gen PGK1, nt-580 a +3, en el extremo 5' las secuencias de reconocimiento para las enzimas NcoI y BamHI y en el extremo 3' una porción correspondiente al principio de la zona codificante del gen PGU1, nt +1 a+22, utilizando los oligonucleótidos 5'-PGK1p (SEQ ID NO 4) y R-PGU1-PGK1p (SEQ ID NO 5).

Por otra parte se amplificó en otra mezcla de reacción (PCR2), la zona codificante del gen PGU1, nt +1 a +1086, en el extremo 5' una porción de la secuencia correspondiente al promotor del gen PGK1, nt-13 a +3, y en el 3' la secuencia de reconocimiento de la enzima BamHI, utilizando los oligonucleátidos F-PGK1p-PGU1 (SEQ ID NO 6) y...

1. Cepa de levadura S. cerevisiae modificada genéticamente para la hiperproducción de la enzima endopoligalacturonasa caracterizada porque comprende en su genoma el gen que codifica para dicha enzima endopoligalacturonasa (PGU1) (SEQ ID NO1) unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) (SEQ ID NO2), ambos de origen S. cerevisiae.

2. Cepa de levadura S. cerevisiae, según la reivindicación 1, depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el nº de identificación 11783.

3. Uso de una cepa de levadura S. cerevisae, según las reivindicaciones 1 y 2, en la elaboración de bebidas alcohólicas fermentadas.

4. Uso de una cepa de levadura S. cerevisae, según la reivindicación 3, en la elaboración del vino.