Célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) modificada genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2,

un gen marcador amplificable seleccionable,

y por lo menos un gen de interés,

en donde la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas, y

en donde dicha célula huésped comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo

Células huésped que presentan propiedades de supervivencia celular mejoradas y métodos para generar las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a células huésped CHO manipuladas genéticamente que comprenden un nivel incrementado de genes bcl-2 o bcl-xL activos, y a métodos para generar dichas células huésped. Más particularmente, la invención se refiere a métodos que modulan el nivel de agentes activos antiapoptosis dentro de las células CHO, y a células CHO que muestran una viabilidad celular incrementada mediante el retraso/inhibición de la muerte celular programada producida naturalmente en dichas células.

Antecedentes de la invención

Las células de mamífero son el huésped preferente para la producción de la mayoría de terapéuticas con proteínas complejas, debido a que las modificaciones post-traduccionales funcional y farmacocinéticamente relevantes son altamente compatibles con el ser humano. Entre los tipos celulares comercialmente relevantes se incluyen hibridomas, mielomas, células de ovario de hámster chino (CHO) y células renales de hámster neonato (BHK). Crecientemente se utilizan derivados de CHO en la industria por su sencilla adaptación para el crecimiento en medio libre de suero/proteínas y su consideración como huéspedes de producción seguros por las agencias reguladoras principales.

Durante los procedimientos de producción biofarmacéutica estándares (operaciones en reactores biológicos), un porcentaje sustancial de la población celular de producción muere como consecuencia de un programa genéticamente determinado denominado apoptosis (Al-Rubeai et al., 1998; Goswami et al., 1999; Lakenet et al., 2001). La apoptosis se conoce como un programa activo de suicidio celular activado como resultado de señales extrínsecas o intrínsecas, tales como la privación de suero, la limitación de nutrientes, la limitación de oxígeno y el estrés mecánico. La apoptosis se caracteriza por la formación de ampollas en la membrana plasmática, la pérdida de volumen celular, la condensación nuclear y la degradación endonucleolítica del ADN a intervalos nucleosómicos (Wyllie et al., 1980).

Se han identificado componentes del suero como importantes agentes protectores efectivos frente a la apoptosis. Sin embargo, existe un fuerte impulso en la industria de la biotecnología, también impulsado por las agencias reguladoras principales de registro de fármacos, para el desarrollo de procedimientos de fabricación libres de suero y de proteínas. Los motivos principales son la reducción de costes, una menor interferencia durante la purificación de proteínas y la reducción del potencial de introducción de patógenos, tales como priones o virus. Sin embargo, la omisión del suero con frecuencia conduce a una sensibilidad incrementada de las líneas celulares de producción frente a la muerte celular programada, provocando que las células sean más vulnerables frente a los insultos no naturales (Franek et al., 1991; Goswami et al., 1999; Moore et al., 1995; Zanghi et al., 1999). La muerte celular programada, por ejemplo mediante apoptosis, representa una pérdida elevada de recursos valiosos, debido a que la producción de proteínas es principalmente una función de la población celular productora viable. Cuanto más tiempo pueda mantenerse una densidad elevada de células viables y productivas en cultivo, más efectivo y rentable resultará el procedimiento de producción debido a los rendimientos de producto más elevadas por cada tiraje de producción. En ausencia de suero, las células mueren más rápidamente al alcanzar la fase de crecimiento estacionario a la densidad celular máxima, acortando de esta manera la etapa de producción. El rendimiento puede reducirse adicionalmente por la degradación del producto por parte de proteasas liberadas por las células apoptóticas y la interferencia durante la recolección causada por el elevado número de residuos celulares.

Se han intentado diversas estrategias de manipulación fisiológica para resolver el dilema de la sensibilidad incrementada la apoptosis de las líneas celulares de producción, particularmente de aquellas líneas celulares que se están adaptando y completamente cultivadas bajo condiciones libres de suero. Algunas de dichas estrategias se centran en la reducción/eliminación de la inducción de programas de respuesta a la apoptosis endógena bajo condiciones de cultivo celular que imitan las de producción. Un enfoque se refiere al alivio de la privación de nutrientes mediante la alimentación (deZengotita et al., 2000; Franek et al., 1996; Mercille et al., 1994; Sanfeliu et al., 1999). Otro método se centra en la utilización de aditivos químicos supresores de la apoptosis para el bloqueo de efectores clave de mecanismos de respuesta apoptótica (Mastrangelo et al., 1999; Sanfeliu et al., 2000; Simpson et al., 1998; Zanghi et al., 2000). Una estrategia alternativa es un enfoque genético. Incluye la manipulación de la célula misma utilizando genes de supervivencia antiapoptóticos o determinantes antiapoptosis manipulados que se derivan de redes reguladoras de mantenimiento de la supervivencia o de virus (Cotter et al., 1995; Chung et al., 1998; Fussenegger et al., 2000; Mastrangelo et al., 1998, 2000a y 2000b; Mercille et al., 1999a y 1999b; Pan et al., 1998; Simpson et al., 1999; Terada et al., 1997; Tey et al., 2000a y 2000b).

De la última estrategia, se ha planteado en la comunidad biotecnológica que bcl-2 y bcl-xL, dos supresores de la apoptosis y miembros clave de una familia de genes reguladores de la respuesta proapoptótica (por ejemplo bad, bak, bax, bok, bcl-xS, bik, bid, hrk, bim, blk, bcl-y) y anti-apoptótica (por ejemplo bcl-2, bel-xL, blc-w, bfl-1, aI, mcl-1, boo, brag-1, nr-13, bhrf-1, ced 9, cdn-1, cdn-2, cdn-3), son potentes candidatos para la manipulación antiapoptosis.

Se ha demostrado que Bcl-2 modula la inducción de la ruta de la apoptosis dependiente de caspasa-9 en la membrana mitocondrial externa en respuesta a un reostato molecular localizado en la membrana mitocondrial externa consistente de proteínas de tipo BCL-2 proapoptóticas y antiapoptóticas homodimerizadas y heterodimerizadas. La expresión sesgada hacia un miembro de una subfamilia proapoptótica mediante limitaciones de cultivo y señales endógenas resulta en la liberación de complejo Apaf-1-caspasa-9 y la autoactivación de esta proteasa que contiene cisteínas específica de aspartato que se correlaciona con un flujo de salida drástico de citocromo c desde la mitocondria hacia el citosol. El ensamblaje de partes importantes de la maquinaria de control de la apoptosis presentes en la membrana mitocondrial externa ha provocado que se centren los esfuerzos de la manipulación antiapoptótica en estas estaciones energéticas de la célula, las cuales actúan como detectores de estrés y ejecutores para el mantenimiento del proceso apoptótico (Follstad et al., 2000; Green et al., 1998; Tsujimoto, 1998).

Existen algunos informes de un efecto positivo de la expresión de un gen bcl-2 anti-apoptótico heterólogo sobre la supervivencia/viabilidad y robustez de líneas celulares manipuladas, adaptado y cultivado en presencia de suero bovino. Entre estas células se incluyen mielomas, hibridomas, células renales de hámster neonato (BHK) y células ováricas de hámster chino (CHO). El efecto positivo de la expresión de BCL-2 se ha descrito en relación a diversas agresiones ambientales, tales como la privación de suero y de glucosa, la retirada de factor de crecimiento o infecciones víricas (Fassnacht et al., 1998; Figueroa et al., 2001; Fussenegger et al., 2000; Itoh et al., 1995; Mastrangelo et al., 2000a y 2000b; Reynolds et al., 1996; Simpson et al., 1997, 1998 y 1999; Tey et al., 2000a y 2000b).

Se ha descrito la manipulación metabólica basada en BCL-xL para células T humanas y células hematopoyéticas CD34⁺, respectivamente (patente US nº 6.143.291, patente WO nº 00/75291). Fussenegger et al., 1998, y también Mastrangelo et al., 2000a y 2000b han descrito un efecto positivo de la expresión de BCL-xL sobre la supervivencia de las células de hámster.

Sin embargo, en la totalidad de dichos informes, se utilizaron líneas celulares no productoras, tales como células T humanas y células hematopoyéticas CD34⁺, o en el caso de que se utilizasen líneas celulares productoras, por ejemplo...

1. Célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) modificada genéticamente mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen antiapoptosis codificante de BCL-xL o de BCL-2,

un gen marcador amplificable seleccionable,

y por lo menos un gen de interés,

en donde la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas, y

en donde dicha célula huésped comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo.

2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que la célula huésped es una célula CHO-DG44, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 o CHO Pro-5, o la progenie de cualquiera de dichas líneas celulares.

3. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-2.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 2.

5. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

7. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el gen marcador amplificable seleccionable codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na⁺K⁺-ATPasa.

8. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 5 a 7, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR, glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na⁺K₊-ATPasa.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, en la que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR.

10. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el gen antiapoptosis, el gen marcador amplificable seleccionable y el gen o genes de interés se encuentran operablemente ligados a por lo menos una secuencia reguladora, permitiendo la expresión de dichos genes.

11. Método para la expresión de un gen antiapoptosis, un gen marcador amplificable seleccionable y por lo menos un gen de interés en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), que comprende:

12. Método para generar células huésped de ovario de hámster chino (CHO) que muestran un nivel incrementado de expresión de un gen antiapoptosis, que comprende:

en el que la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio de cultivo sin suero y/o sin proteínas.

13. Método según la reivindicación 12, en el que el gen o genes de interés se introducen en la población de células huésped de ovario de hámster chino (CHO).

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el gen antiapoptosis presenta la secuencia SEC ID nº 1, SEC ID nº 3, SEC ID nº 5, SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 ó SEC ID nº 11.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el gen marcador amplificable seleccionable codifica dihidrofolato reductasa (DHFR), glutamina sintetasa, CAD, adenosina desaminasa, adenilato desaminasa, UMP sintetasa, IMP 5'-deshidrogenasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, HGPRTasa, timidina quinasa, timidilato sintetasa, glucoproteína P 170, ribonucleótido reductasa, asparagina sintetasa, arginosuccinato sintetasa, ornitina descarboxilasa, HMG-CoA reductasa, acetilglucosaminiltransferasa, treonil-ARNt sintetasa o Na⁺K⁺-ATPasa.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable seleccionable para DHFR.

19. Método para generar una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), que comprende:

en el que la célula se cultiva en suspensión y se cultiva en un medio sin suero y/o sin proteínas, y

en el que dicha célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) comprende por lo menos 5 copias de dicho gen antiapoptosis heterólogo.

20. Método según la reivindicación 19, en el que el gen marcador amplificable seleccionable es DHFR y el agente selectivo metotrexato.

21. Método según la reivindicación 19, en el que el gen marcador amplificable seleccionable es glutamina sintetasa y el agente selectivo es metionina sulfoximina (MSX).

22. Método según la reivindicación 19, en el que el gen antiapoptosis codifica BCL-xL.

23. Células huésped obtenibles mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22.

24. Procedimiento para producir una proteína de interés en una célula huésped, que comprende:

25. Utilización de una célula según las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 para la producción de por lo menos una proteína codificada por un gen de interés.

26. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 10 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

27. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 20 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

28. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 50 copias del gen antiapoptosis heterólogo.

29. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ó 23 que comprende por lo menos 100 copias del gen antiapoptosis heterólogo.