QUERATINOCITOS UTILIZABLES COMO SUBSTANCIA BIOLOGICAMENTE ACTIVA PARA EL TRATAMIENTO DE HERIDAS.
Queratinocitos, caracterizados porque, no están inmortalizados,
y se pueden duplicar por lo menos 150 veces mediante un procedimiento de cultivo celular in vitro, y porque se trata de células del cultivo KC-BI-1 (DSM ACC 2514), ó de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los citados queratinocitos no pueden duplicarse
a. en ausencia de suero fetal de ternera, y/o
b. en ausencia de células Feeder y/o
c. en ausencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF)
y en donde la actividad telomerasa de los citados queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor, por lo menos en un factor 2,
y en donde las células y cultivos de los queratinocitos derivados se generan y/o pueden ser generados mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original KC-BI-1 (DSM ACC 2514)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP02/11459.
Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH & CO.KG.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH & CO. KG04254932CASE 1-1258,55216 INGELHEIM AM RHEIN.
Inventor/es: NOE,WOLFGANG, EBERHARDT,PETRA, REIF,KATHARINA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 14 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61L15/40 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › A61L 15/00 Aspectos químicos de vendas, apósitos o compresas absorbentes o utilización de materiales para su fabricación (para vendas líquidas A61L 26/00; apósitos radiactivos A61M 36/14). › que contienen ingredientes de constitución indeterminada o sus productos de reacción.
- C12N5/06B12A
Clasificación PCT:
- C12N5/07 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos animales.
Clasificación antigua:
- C12N5/08
Fragmento de la descripción:
Queratinocitos utilizables como substancia biológicamente activa para el tratamiento de heridas.
Campo de la invención
La invención se refiere a nuevos queratinocitos cultivables in vitro, así como su ventajoso empleo para la obtención de un producto, el cual puede ser empleado para el tratamiento de heridas agudas y crónicas. La invención ha tenido lugar en el terreno de la medicina, especialmente en el terreno de la curación de heridas, mediante Tissue Engineering (ingeniería de tejidos).
Estado actual de la técnica
Los queratinocitos alogénicos se emplean con éxito desde hace mucho tiempo para el tratamiento de heridas, en particular de úlceras y/o quemaduras (Maier, 1993; Schönfeld et al., 1993). Las heridas, que se muestran resistentes frente a las terapias convencionales durante un largo período de tiempo, se pueden curar con éxito mediante el empleo de los queratinocitos alogénicos, (Phillips and Gilchrest, 1993; Beele et al., 1991; Leigh et al., 1991; Lindgren et al., 1998). Al principio, la atención se dirigió al empleo de los queratinocitos alogénicos especialmente en la substitución de la piel, es decir en la regeneración de la epidermis transplantada. Sin embargo, se observó pronto, que el éxito de la terapia radicaba primariamente sobre la estimulación de la reepitelización endógena, y no sobre un "crecimiento" del transplante celular alogénico de la herida. Numerosas investigaciones dieron por resultado últimamente que los queratinocitos transplantados permanecen solamente un determinado tiempo en la herida y entonces no son visiblemente eliminados clínicamente del cuerpo (Kawai et al., 1993). La estimulación de la curación endógena de las heridas tiene lugar primordialmente mediante una espaciosa y óptima liberación en el tiempo de una multitud de diferentes factores de crecimiento, citocinas, matriz extracelular (ECM), moléculas más pequeñas, y proteasas, mediante los queratinocitos alogénicos (Lang et al., 1996; Marcusson et al., 1992). La complejidad y multiplicidad de los factores liberados justifica la ventaja terapéutica frente a las terapias individuales convencionales, por ejemplo con factores de crecimiento aislados. Junto al efecto principal de la reepitalización aparecen mediante el tratamiento con queratinocitos, también cambios detectables macroscópica y microscópicamente en el tejido de granulación (Lang et al., 1996). Otro efecto beneficioso para los pacientes y a menudo descrito de los queratinocitos se refiere a la marcada analgesia después del transplante (Schönfeld et al., 1993).
Para la curación de heridas es ventajoso el empleo de queratinocitos activos en el proceso de partición, indiferenciados, puesto que parece que dichos queratinocitos activos en el proceso de partición disponen de un complejo perfil de secreción de apoyo para la curación de heridas. Con excepción de las células madres, los queratinocitos indiferenciados pierden in vivo su potencial de proliferación en el curso de la natural diferenciación ya después de pocas particiones celulares, un proceso que en cambio en el cultivo in vitro de los queratinocitos siempre hasta ahora había sido observado (Barrandon and Green, 1987). Por consiguiente, los queratinocitos activos en la partición, particularmente apropiados hasta ahora para la curación de heridas, sólo se podían cultivar finalmente in vitro, lo cual hacía que su empleo en medicina fuera difícil y costoso.
Los queratinocitos alogénicos se emplean terapéuticamente, bien directamente en forma de las llamadas "láminas de queratinocitos" que consisten en una agrupación de células enzimáticamente disueltas compuestas de varias capas, o juntamente con soportes biocompatibles con el nombre de "compresas biológicamente activas para la curación de heridas". Finalmente, tienen la ventaja de que dichas células no deben ser tratadas enzimáticamente antes de su empleo disolviéndolas del fondo de la cápsula de cultivo. Además el empleo de membranas biocompatibles como soporte para el cultivo de queratinocitos (EP 0 462 462, US 5.658.331; US 5.693.332; EP 0 518 920), hace posible un temprano acabado de la compresa biológicamente activa para curación de heridas, puesto que las células no deben formar ninguna asociación cerrada de células. Ya pueden emplearse los soportes crecidos subconfluentemente para el tratamiento de heridas. Junto a una temprana disponibilidad, el empleo de asociaciones celulares subconfluyentes tiene adicionalmente la ventaja, de que con respecto a los queratinocitos cultivados hay pocos fuertemente diferenciados y de esta forma son ventajosos para el tratamiento de heridas.
Los queratinocitos pueden crioconservarse sin ningún efecto desventajoso para la curación de heridas directamente, o juntamente con materiales de soporte biocompatibles, a temperaturas entre -30 y -196ºC, de preferencia entre -70 y -90ºC (De Luca et al., 1992; Teepe et al., 1993). Esto mejora de nuevo su utilidad terapéutica, puesto que permite tener en existencia una cierta provisión de compresas biológicamente activas para curación de heridas.
Objetivo de la invención
Los queratinocitos conocidos en el estado actual de la técnica así como sus compresas biológicamente activas obtenidas para curación de heridas, están disponibles actualmente con ciertas desventajas, cuya superación es un objetivo de la presente invención.
Una manifiesta desventaja de los queratinocitos de origen primario conocidos hasta el momento, consiste en que dichas células, mediante el procedimiento de cultivo de células in vitro, solamente pueden duplicarse pocas generaciones de células sin perder su alta actividad de división y con ello su preferida idoneidad para la obtención de compresas biológicamente activas para curación de heridas. Según el estado actual de la técnica al experto le es solamente posible multiplicar el número de células mediante cultivo in vitro, alrededor de aproximadamente 103 a 104 (Tanczos et al., 1999).
Otra desventaja condicionada por lo expuesto, consiste en que el cultivo in vitro de los citados queratinocitos hace necesario una frecuente y costosa nueva separación; lo cual tiene de nuevo como consecuencia que el material de células obtenido y multiplicado no sea uniforme y con ello las compresas de curación de heridas obtenidas presentan con una alta probabilidad, diferencias de calidad o por lo menos pueden presentarlas.
Otra desventaja consiste en que con el nuevo aislamiento de los queratinocitos a partir de diferentes donantes existe un alto riesgo de infección para los receptores de la compresa de curación de heridas. Hay que pensar aquí, por ejemplo, en un HIV ó un elevado riesgo de hepatitis.
Descripción de la invención
El objeto de la invención son los queratinocitos, caracterizados porque, no están inmortalizados y se pueden duplicar mediante el procedimiento de cultivo celular in vitro por lo menos 150 veces, y porque se trata de células del cultivo KC-BI-1 (DSM ACC 2514), o se trata de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los queratinocitos citados, no pueden duplicarse
y en donde la actividad de los citados queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor aproximadamente en un factor 2,
y en donde las células derivadas de queratinocitos y los cultivos se generan y/o pueden ser generados mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original KC-BI-1 (DSM ACC 2514). A consecuencia de esto resulta una multiplicación celular alrededor de aproximadamente 1044 veces. Los correspondientes queratinocitos conservan con ello sus ventajosas propiedades para el tratamiento de heridas.
En los queratinocitos según la invención, se trata de queratinocitos primarios cultivables in vitro aislados de un donante, en donde el aislamiento y el cultivo inicial puede ser efectuado por un experto por ejemplo por el correspondiente procedimiento descrito por Rheinwald y Green 1975.
La invención se refiere a queratinocitos, aislados de la parte epidérmica de un prepucio. Se depositaron queratinocitos de origen humano, del cultivo KC-BI-1, el día 27 de junio de 2001 en la DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und...
Reivindicaciones:
1. Queratinocitos, caracterizados porque, no están inmortalizados, y se pueden duplicar por lo menos 150 veces mediante un procedimiento de cultivo celular in vitro, y porque se trata de células del cultivo KC-BI-1 (DSM ACC 2514), ó de queratinocitos derivados de los mismos, en donde los citados queratinocitos no pueden duplicarse
y en donde la actividad telomerasa de los citados queratinocitos en comparación con la línea celular HaCaT es menor, por lo menos en un factor 2,
y en donde las células y cultivos de los queratinocitos derivados se generan y/o pueden ser generados mediante subpasajes y/o subclonados del cultivo original KC-BI-1 (DSM ACC 2514).
2. Producto que consta de un soporte, el cual está recubierto de queratinocitos según la reivindicación 1,
3. Producto según la reivindicación 2, caracterizado porque, el soporte se trata de un material de soporte biocompatible, el cual puede emplearse para la obtención de un medicamento.
4. Producto según la reivindicación 3, caracterizado porque, el material de soporte es una membrana biodegradable hidrófoba o hidrófila.
5. Producto según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque, el soporte se trata de un polímero de ácido hialurónico esterificado, de preferencia una lámina de polímero perforada con una geometría definida, en donde la lámina de polímero tiene un grueso de 10 a 500 µm y está perforada con agujeros con un tamaño entre 10 y 1000 µm, en donde los orificios tienen un tamaño definido y constante, y forman una serie ordenada, en donde están separados entre sí a una distancia constante de 50 a 1000 µm.
6. Producto según las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque, el material de soporte se trata de poliésteres, policarbonatos, polianhídridos, poliortoésteres, polidepsipéptidos, polieterésteres, ácidos poliamínicos o polifosfazenos,
7. Procedimiento para la crioconservación de los queratinocitos según la reivindicación 1, o un producto según las reivindicaciones 2-6, en el cual los queratinocitos o el producto se crioconservan a una temperatura de -20ºC a -196ºC, de preferencia de -60 a -80ºC.
8. Queratinocitos según la reivindicación 1 ó producto de queratinocitos y soporte, según las reivindicaciones 2-6, los cuales/el cual están/está tratados/tratado según el procedimiento descrito en la reivindicación 7.
9. Queratinocitos según las reivindicaciones 1 y 8, ó producto según las reivindicaciones 2-6, para el empleo en medicina.
10. Empleo de los queratinocitos según la reivindicación 1 y 8, ó de un producto según las reivindicaciones 2-6, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de heridas.
11. Empleo según la reivindicación 10, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de quemaduras y/o úlceras.
12. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de quemaduras de segundo grado.
13. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de úlceras de la pierna crónicas que curan difícilmente, del tipo Ulcus cruris, de preferencia Ulcus cruris venosum.
14. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de un Ulcus asociado a la diabetes.
15. Empleo según la reivindicación 11, en donde en el caso de las heridas se trata de preferencia de un decubitus.
16. Empleo según las reivindicaciones 11-15 como complemento a, o en combinación con, el empleo de una o varias otras substancias con un efecto positivo para la curación de heridas.
17. Empleo según la reivindicación 16, en donde en el caso de la otra substancia se trata de compresas de hidrocoloide.
18. Empleo según la reivindicación 16, en donde en el caso de la otra substancia se trata de substancias antimicrobianas, como por ejemplo antibióticos.
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