Métodos de eliminación celular.

Métodos de eliminación celular.

La presente invención está relacionada con metodologías de eliminación de células que expresan en su superficie antígenos determinados,

en particular células germinales primordiales de un embrión aviar y células tumorales, las cuales no producen daños en otras poblaciones celulares. Tales metodologías están basadas en el marcaje selectivo de las células a eliminar con anticuerpos específicos y posterior destrucción celular de las células marcadas con el sistema del complemento. La invención se relaciona también con los embriones aviares y las aves quimera germinales derivados de dichas metodologías.

MÉTODOS DE ELIMINACIÓN CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con metodologías para la eliminación de células que presentan en su superficie un determinado antígeno, en particular células germinales primordiales de un embrión aviar y células tumorales, mediante reconocimiento de dicho antígeno y unión por parte de un anticuerpo específico y posterior unión de proteínas del complemento, así como con embriones aviares y aves quimera germinales resultantes de dichas metodologías.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las peculiaridades morfo-fisiológicas de los embriones aviares condicionan fuertemente los procedimientos de reproducción asistida que permiten la propagación de un genotipo o una estirpe concreta a partir de células germinales crioconservadas ex situ. Uno de tales procedimientos consiste en la construcción de quimeras de línea germinal mediante injerto, en periodo embrionario, de las células germinales primordiales de la estirpe deseada sobre un embrión receptor de otro linaje diferente. Las células germinales primordiales (CGP) son las células embrionarias que desde un periodo muy temprano del desarrollo están ya determinadas para colonizar las gónadas y dar allí lugar a las células germinales (espermatogonias y oogonias y los gametos de ellas derivados). Cuando a un embrión en desarrollo se le injertan células germinales primordiales exógenas (por ejemplo, de una raza en peligro de extinción cuyas células germinales primordiales hayan sido conservadas en congelación y que se desea propagar para restaurar una diversidad genética amenazada) éstas migrarán a, y colonizarán, las gónadas del receptor del mismo modo que lo habrían hecho en el embrión del que fueron extraídas. El receptor se convierte así en una quimera germinal cuyas gónadas portarán células germinales (y producirán gametos) de las dos estirpes diferentes, la del propio receptor y la injertada. Cuando esta quimera germinal, ya adulta, se aparee de forma natural o asistida generará progenies de una u otra línea en proporción variable según el grado de quimerismo logrado, es decir, según la proporción entre las células germinales propias del receptor y las células germinales injertadas. De este modo, se recupera en la primera generación filial aquel genotipo que en su día fue crioconservado en forma de CGP.

Para mejorar los rendimientos de la técnica es importante aumentar en la medida de lo

posible el grado de quimerismo, para lo cual se aplican, con anterioridad al injerto, tratamientos conducentes a la inactivación parcial de la línea germinal del embrión receptor. Comúnmente, los métodos empleados son la irradiación y la administración de fármacos citotóxicos. En el primer caso se somete el huevo embrionado a una dosis predeterminada de radiación gamma o radiación X, cuyo efecto citotóxico es bien conocido; en el segundo suele emplearse el fármaco busulfán, un agente alquilante, que interfiere en la replicación del ADN provocando apoptosis celular, de toxicidad bien conocida. Ambos métodos son efectivos, pero totalmente inespecíficos, afectando por igual a todas las poblaciones de células embrionarias, de ahí que solo puedan aplicarse de manera restringida a fin de evitar daños en la viabilidad del embrión receptor y, por ende, el fracaso del procedimiento en su conjunto, resultando así que tan solo se logra, habitualmente, una limitada ablación de la línea germinal embrionaria del receptor.

Los procedimientos de irradiación o de tratamiento farmacológico para la ablación de células germinales descritos anteriormente se vienen aplicando con los fines descritos desde hace décadas. La acción del busulfán sobre las células germinales ha sido descrita tanto en rata como en aves. Desde entonces ha sido utilizado de forma generalizada con el fin de destruir las CGP en sus periodos de migración y proliferación embrionarias. De igual manera, la irradiación X o y, cuyo efecto nocivo sobre la viabilidad celular es bien conocido se ha venido utilizando con el propósito de diezmar la población de CGP. La irradiación tiene, frente al tratamiento con busulfán, la ventaja de que la dosis efectiva a la que el embrión queda expuesto puede ajustarse con gran precisión, sin embargo tiene el inconveniente de que es igualmente nocivo para todas las poblaciones celulares, independientemente del momento del ciclo celular en que se encuentren.

Por otra parte, la acción citotóxica combinada de los anticuerpos y el sistema endógeno del complemento es bien conocida y se ha aplicado con diferentes fines terapéuticos y/o experimentales. Así, la combinación de complemento sérico con anticuerpos frente a células de carcinoma de Brown-Pearce logra inhibir el crecimiento del tumor en conejos previamente injertados con células cancerosas (Kalfayan B & Kidd JG 1953 J Exp Med 97(1): 145-162). Esta estrategia se ha utilizado con éxito en la terapéutica del cáncer, con más de 20 anticuerpos de diversas naturalezas ya autorizados por distintos organismos reguladores para el tratamiento de diferentes neoplasias (Macor & Tedesco 2007 Immunol Lett 111: 6-13). Uno de los problemas de ésta terapia es que el tumor es capaz de producir enzimas inhibidoras del sistema de complemento endógeno y así evadir la destrucción dirigida por los anticuerpos. Igualmente, la acción lítica del complemento se ha utilizado para destruir selectivamente una población de células musculares y nerviosas

embrionarias que expresan un determinado antígeno de superficie en embriones de pollo (Gerhart J etal. 2008 Biol Proced Online 10: 74-82).

Por otro lado, en el estado de la técnica se han descrito métodos de eliminación selectiva de células germinales primordiales en pez cebra, basados en el sistema bacteriano bicistrónico parD (Slanchev K et al. 2005 Proc Nati Acad Sci 102: 4074-4079).

A pesar de todo ello, aún existe la necesidad de desarrollar metodologías que permitan la eliminación selectiva de una población celular particular y que no resulten citotóxicas para otras poblaciones celulares, mediante las cuales puedan obtenerse quimeras aviares de línea germinal con un alto grado de quimerismo, con mayor especificidad de eliminación de células germinales primordiales y menor citotoxicidad para otros tipos celulares diferentes de las células germinales primordiales, así como la eliminación de células tumorales en un individuo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado una metodología para la eliminación de células que expresan en su superficie antígenos determinados sin producir daños en otras poblaciones celulares. La metodología desarrollada está basada en el mareaje selectivo de las células a eliminar con anticuerpos específicos y posterior destrucción celular de las células marcadas con el complemento. Los autores de la presente invención han logrado marcar y destruir las células germinales primordiales de embriones de ave (ver Ejemplo 1) para su posterior uso como receptores de injertos de células germinales primordiales de otras especies, para poder así propagarlas. El método desarrollado por los inventores no afecta de forma sustancial a otras poblaciones celulares, por lo que no compromete la viabilidad general del embrión receptor.

Frente a los procedimientos comúnmente utilizados en la técnica (principalmente basados en radiación o en citotoxicidad) para la eliminación de células germinales primordiales, el método aquí descrito no requiere el uso de una equipación especial (tal como fuentes de radiación gamma), por lo que supone una ventaja en cuanto a costes y dotación de laboratorio necesaria frente a otras metodologías. Por otro lado, el método aquí descrito se caracteriza por su especificidad, de modo que, al ser aplicado en las dosis y pautas propuestas, resulta menos lesivo para el desarrollo de los embriones, por lo que resulta en un mejor rendimiento global. Además, en relación con la especificidad del método de eliminación de células germinales primordiales de un embrión aviar aquí descrito, permite una ablación casi completa (ausencia de células visibles en secciones de tejido gonadal) de

la población diana, a diferencia de los procedimientos habituales descritos en la técnica, en los que la población de células germinales primordiales se reduce en menos de un 50%.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método de eliminación de células germinales primordiales en un embrión de un ave que comprende:

(i) poner en contacto las células germinales primordiales del embrión con un anticuerpo específico de un antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales,... [Seguir leyendo]

1. Un método de eliminación de células germinales primordiales en un embrión de un ave que comprende:

- poner en contacto las células germinales primordiales del embrión con un anticuerpo específico de un antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales, y

- poner en contacto, bien a continuación o bien simultáneamente con respecto a la etapa anterior, las células germinales primordiales con una composición que comprende proteínas del sistema del complemento con capacidad de inducir lisis de células que presentan un anticuerpo unido a su superficie.

2. El método según la reivindicación anterior, en donde la puesta en contacto con el anticuerpo específico de un antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales se lleva a cabo en un estadio del desarrollo embrionario previo a la migración y colonización gonadal por parte de dichas células germinales primordiales.

3. El método según la reivindicación anterior, en donde dicho estadio de desarrollo embrionario es el estadio HH15 o un estadio anterior.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la puesta en contacto con el anticuerpo específico de un antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales y con la composición que comprende proteínas del sistema de complemento se lleva a cabo mediante administración de dicho anticuerpo específico y de dicha composición que comprende proteínas del complemento mediante aplicación subgerminal, o mediante aplicación sobre membrana perivitelina.

5. El método según la reivindicación anterior, en donde la puesta en contacto con el anticuerpo específico de un antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales y, a continuación, con la composición que comprende las proteínas del sistema de complemento se lleva a cabo mediante administración de dicho anticuerpo específico y de dichas proteínas del complemento

mediante aplicación subgerminal.

6. El método según la reivindicación anterior, en donde la administración mediante aplicación subgerminal se produce entre los estadios X y XII del embrión.

7. El método según la reivindicación 4, en donde la administración mediante aplicación sobre membrana perivitelina se produce en un estadio anterior al estadio HH5 del embrión.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las proteínas del sistema del complemento son exógenas respecto del ave.

9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo específico del antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-SSEA1 (anti- antígeno embrionario estadio-específico 1), un anticuerpo anti-EMA-1 (anti-antígeno

1 de membrana epitelial),un anticuerpo anti-SSEA3 (anti-antígeno embrionario estadio-específico 3), un anticuerpo anti-SSEA4 (anti-antígeno embrionario estadio- específico 4), un anticuerpo anti-integrina a6 y un anticuerpo anti-integrina p1.

10. El método según la reivindicación anterior, en donde el anticuerpo específico del antígeno presente en la superficie celular de dichas células germinales primordiales es un anticuerpo anti-SSEA1.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ave es un ave del género Gallus.

12. Un embrión aviar en el que se han eliminado al menos parte de las células germinales primordiales, obtenido mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un método de obtención de un embrión aviar quimera germinal que comprende:

- eliminar las células germinales primordiales de un embrión de una primera ave mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, e

- injertar en el embrión de dicha primera ave células germinales primordiales

obtenidas a partir del embrión de una segunda ave.

14. El método según la reivindicación anterior, en donde la segunda ave es un ave en peligro de extinción o es un ave transgénica.

15. Un embrión aviar quimera germinal, obtenido mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

16. Un método de obtención de un ave quimera germinal, que comprende

- implantar en un embrión aviar obtenido de acuerdo con el método

según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 células germinales primordiales de un segundo ave y

- mantener el embrión obtenido en la etapa anterior en condiciones adecuadas hasta completar su desarrollo embrionario.

17. Un ave quimera germinal obtenida mediante un método según las reivindicaciones 13 o 14 que contiene células germinales primordiales de una segunda ave.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

N.° solicitud:

Fecha de presentación de la solicitud: 14.11.2014 Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

© lnt.CI.: C12N15/873 (2010.01)

C07K16/28 (2006.01)

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afectadas

X

WO 9838283 A1 (UNIV GUELPH et al.) 03.09.1998, todo el documento.

VAN DE LAVOIR, M. C., et al. Fligh-grade transgenic somatic chimeras from chicken embryonic stem cells. Mechanisms of Development, ELSEVIER SCIENCE IRELAND LTD, IE 2006 VOL: 123 No: 1 Pags: 31-41 ISSN 0925^773 Dol: doi:10.1016/j.mod.2005.10.002 Wittbrodt Joachim; Volbehr Ute. Ver todo el documento.

ELDER, J., et al. MyoD Positive Cells of the Pregastrulatlng Embryo are Critical for Morphogenesis and Skeletal Muscle Differentlatlon. Society for Development Blology 64th Annual Meeting. Developmental Biology, Academlc Press, AMSTERDAM, NL 15.07.2005 VOL: 283 No: 2 Abs n° 302 Págs: 637 ISSN 0012-1606 Dol: dol:10.1016/j.ydblo.2005.04.040 Schlosser Gerhard. Ver todo el documento.

US 2003115622 A1 (PONCE DE LEON F ABEL et al.) 19.06.2003, todo el documento, especialmente párrafos [0048],[0075]-[0130],

US 2012149014 A1 (ALLMAN RICHARD et al.) 14.06.2012, todo el documento, especialmente párrafos [0065],[0169]-[0174],

JUNG, J. G., et al. Development of novel markers for the characterization of chicken primordial germ cells. Stem Cells,ALPHAMED PRESS, DAYTON, OH, US 01.05.2005 VOL: 23 No: 5 Págs: 689-698 ISSN 1066-5099. Ver todo el documento.

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