BIOCATALIZADORES Y SUS APLICACIONES.

Biocatalizadores y sus aplicaciones.

Las proteínas de cápsida viral de virus de la familia Potyviridae según la presente invención pueden ser utilizadas como soporte en la inmovilización de enzimas de interés,

mediante el empleo de un agente de entrecruzamiento adecuado para la unión de la proteína de cápsida viral y del enzima de interés.

Biocatalizadores y sus aplicaciones.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al área de la inmovilización de biocatalizadores y se relaciona con compuestos que suponen la inmovilización enzimática sobre un soporte de cápsida viral, en donde la inmovilización tiene como resultado un aumento en la actividad enzimática específica del enzima inmovilizado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Dado que el número de procesos catalizados por enzimas en la industria es cada vez mayor, la inmovilización de enzimas es de gran interés en sectores tales como el químico, farmacéutico o alimentario, así como en procesos tales como el tratamiento de residuos, métodos de diagnóstico y/o de tratamiento de enfermedades, etc.

La nanotecnología ha suscitado un reciente interés en la inmovilización enzimática debido a sus potenciales aplicaciones en Biotecnología y Biomedicina. La inmovilización enzimática conlleva ventajas asociadas a la manipulación, separación del enzima de la mezcla de reacción, reutilización del enzima, reducción de costes y posibilidad de aumentar la estabilidad térmica y el rango de pH de actuación del enzima. En el campo de la nanotecnología, los factores que determinan la eficiencia de los biocatalizadores vienen dados por el área de la superficie, la resistencia a la transferencia de masa, y la carga enzimática efectiva. Se han descrito diversos nanomateriales en relación con biocatalizadores: nanopartículas, nanofibras, nanotubos, y matrices nanoporosas. Un requisito importante en la inmovilización de una proteína es que la matriz proporcione un entorno biocompatible e inerte, es decir, que no interfiera con la estructura nativa de la proteína.

Desde el punto de vista bioquímico, la inmovilización enzimática aporta una serie de ventajas, tales como:

- disminución de problemas de autolisis (proteasas) o de agregación, al estar limitados los movimientos rotacionales y traslacionales,

-ralentización de los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-función,

- simulación de reacciones in vivo,

- simulación de sistemas estructuralmente asimétricos (tales como estudios de membranas) ,

- en sistemas entrecruzados, pueden fijarse interacciones con fosfolípidos, polisacáridos, etc. para simular orgánulos celulares,

- unión multipuntual a soportes deformables que permite estudiar la deformación de proteínas globulares, y

- especificidad de sustrato.

Asimismo, la inmovilización enzimática plantea una serie de desventajas, tales como la disminución en la actividad enzimática del enzima inmovilizado, la dificultad en la interpretación de los datos si la preparación enzimática no es homogénea, y la posibilidad de contactos proteína-proteína indeseados.

Desde un punto de vista aplicado, la inmovilización enzimática plantea una serie de ventajas: aumento de la estabilidad enzimática, aumento de la productividad enzimática debido a la posibilidad de reutilización, facilidad de recuperación del enzima, de purificación de los productos y, en general, de operación y control del proceso. Por otro lado, como inconvenientes, cabe destacar que generalmente la actividad enzimática disminuye, aumentan los problemas difusionales, aumenta el coste del proceso y el hecho de que el intervalo de pH de trabajo puede ser diferente al del biocatalizador nativo.

En el estado de la técnica se han descrito enzimas inmovilizados en una variedad de soportes (scaffolds) , tales como nanotubos de silicio, bicapas fosfolipídicas, monocapas auto-ensambladas, matrices poliméricas, en películas Langmuir-Blodgett, partículas de látex poliestireno, partículas de oro ensambladas en polímeros y zeolita o películas lipídicas evaporadas térmicamente, nanopartículas magnéticas y no magnéticas, entre otras.

Se han descrito diversas aplicaciones de enzimas inmovilizados en nanopartículas (Ansari SA & Husain Q 2012 Biotech Adv 30: 512-523) y en nanotubos de carbono (Feng W & Ji P 2011 Biotech Adv 29: 889-895) . La solicitud de patente internacional WO2008133433 está dirigida a métodos de exposición de proteínas, azúcares o ácidos nucleicos sobre la superficie de esporas, virus, bacterias y levaduras. Cardinale D et al. (2012 Trends Biotech 30 (7) : 369-376) describe el desarrollo de nanotrasportadores enzimáticos (enzyme nano-carriers, ENCs) basados en virus de plantas, bacteriófagos y partículas similares a virus (virus-like particles, VLPs) como soporte (scaffold) para, entre otros, el confinamiento enzimático. Se han descrito diferentes metodologías para la inmovilización de enzimas de interés comercial tal como la lipasa B de Candida antarctica (CALB) , habitualmente basados en proteínas de fusión (Idris A & Bukhari A 2012 Biotechnol Adv 30: 550-563; Mateo C et al. 2007 Enzyme Microb Tech 40: 1451-1463; Carette N et al. 2007 Nature Nanotechnol 2: 226- 229; Minten IJ et al. 2011 Chem Sci 2: 358-362) .

A la vista del estado de la técnica en el área de la inmovilización enzimática, es necesario desarrollar sistemas alternativos a los descritos que, ventajosamente, no requieran la generación de proteínas de fusión, resultando así más fáciles y rápidos y que, convenientemente, permitan obtener una mayor actividad enzimática específica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un biocatalizador que comprende

-un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y

-un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática,

en donde dicho polipéptido A está unido al polipéptido B mediante un agente de entrecruzamiento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un virus de la familia Potyviridae que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una VLP de un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención del biocatalizador anterior, que comprende poner en contacto un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención del virus anterior, que comprende poner en contacto un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de obtención de la VLP anterior que comprende poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inmovilizar un enzima que comprende conjugar un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae con un polipéptido B que comprende un enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, mediante un agente de entrecruzamiento.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de

(i) un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae,

(ii) un virus de la familia Potyviridae, o

(iii) una VLP que comprende proteínas de cápsida de un virus de la familia Potyviridae para la inmovilización de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.

En un último aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la conversión enzimática de un sustrato en un producto que comprende poner en contacto dicho sustrato con el biocatalizador anterior, o con el virus anterior o con la VLP anterior, en donde el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática presente... [Seguir leyendo]

1. Un biocatalizador que comprende

-un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, y

-un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática,

en donde dicho polipéptido A está unido al polipéptido B mediante un agente de entrecruzamiento.

2. Biocatalizador según la reivindicación 1, en donde la proteína de la cápsida forma parte de un virus o de una VLP.

3. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la proteína de cápsida es una proteína de la cápsida de un Potyvirus.

4. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de cápsida es una proteína de la cápsida del virus del mosaico del nabo (TuMV) .

5. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el enzima es una lipasa.

6. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el enzima es la lipasa B de Candida antarctica.

7. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente de entrecruzamiento es glutaraldehido.

8. Biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende, además, al menos un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido al polipéptido A mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une el polipéptido A con el polipéptido B.

9. Biocatalizador según la reivindicación 8, en donde dichos enzimas comprendidos por los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.

10. Un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento.

11. Virus según la reivindicación 10, en donde el virus es un Potyvirus.

12. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 ú 11, en donde el virus es el virus del mosaico del nabo (TuMV) .

13. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el enzima es una lipasa.

14. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el enzima es la lipasa B de

Candida antarctica.

15. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el agente de entrecruzamiento es glutaraldehido.

16. Virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en donde el virus comprende, además, al menos un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido al virus mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une el virus con el polipéptido B.

17. Virus según la reivindicación 16, en donde dichos enzimas comprendidos por los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.

18. Una VLP de un virus de la familia Potyviridae que comprende un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática unido a una proteína de la cápsida de dicho virus mediante un agente de entrecruzamiento.

19. VLP según la reivindicación 18 en donde el virus es un Potyvirus.

20. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, en donde el virus es el virus del mosaico del nabo (TuMV) .

21. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde el enzima es una lipasa.

22. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde el enzima es la lipasa B de

Candida antarctica.

23. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde el agente de entrecruzamiento se selecciona del grupo formado por glutaraldehido y (…) .

24. VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, en donde la VLP comprende, además, al menos un polipéptido C que comprende un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, en donde dicho polipéptido C está unido a la VLP mediante un agente de entrecruzamiento, en donde dicho agente de entrecruzamiento puede ser el mismo o diferente al agente de entrecruzamiento que une la VLP con el polipéptido B.

25. VLP según la reivindicación 24, en donde dichos enzimas comprendidos por los polipéptidos B y C se seleccionan de modo que el producto resultante de la reacción enzimática catalizada por uno de los enzimas es el sustrato de la reacción enzimática catalizada por el otro enzima.

26. Método de obtención de un biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende poner en contacto un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho biocatalizador.

27. Método según la reivindicación 26, que comprende

(i) activar el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido A – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.

28. Método según la reivindicación 26, que comprende

(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido A.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en donde la proteína de cápsida forma parte de un virus o de una VLP.

30. Método de obtención de un virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, que comprende poner en contacto un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicho virus.

31. Método según la reivindicación 30, que comprende

(i) activar las proteínas de cápside del virus con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [virus – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.

32. Método según la reivindicación 30, que comprende

(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el virus.

33. Método de obtención de una VLP según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, que comprende poner en contacto una VLP de un virus de la familia Potyviridae, con un polipéptido B que comprende un enzima

o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en presencia de un agente de entrecruzamiento, bajo condiciones adecuadas para la formación de dicha VLP.

34. Método según la reivindicación 33, que comprende

(i) activar la VLP con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [VLP – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar el complejo resultante en (i) con el polipéptido B.

35. Método según la reivindicación 33, que comprende

(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento, para formar un complejo [polipéptido B – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con la VLP.

36. Método para inmovilizar un enzima que comprende conjugar un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae con un polipéptido B que comprende un enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, mediante un agente de entrecruzamiento.

37. Método según cualquiera la reivindicación 36, en donde la proteína de la cápsida forma parte de un virus o de una VLP.

38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 o 37, que comprende

(i) activar el polipéptido A con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido A – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido B.

39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 o 37, que comprende

(i) activar el polipéptido B con el agente de entrecruzamiento para formar un complejo [polipéptido B – agente de entrecruzamiento], y

(ii) conjugar dicho complejo resultante en (i) con el polipéptido A.

40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39 en donde el virus es un Potyvirus.

41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40 en donde el virus es el virus del mosaico del nabo (TuMV) .

42. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41 en donde el enzima es una lipasa.

43. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42 en donde el enzima es la lipasa B de

Candida antarctica.

44. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43, en donde el agente de entrecruzamiento es glutaraldehido.

45. Método según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, que comprende, además, inmovilizar un segundo enzima, que comprende conjugar dicho polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae, conjugar con un polipéptido C que comprende dicho segundo enzima o un fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática, en donde dicho segundo enzima es un enzima diferente al enzima comprendido en el polipéptido B, mediante un agente de entrecruzamiento.

46. Uso de

(i) un polipéptido A que comprende una proteína de la cápsida de un virus de la familia Potyviridae,

(ii) un virus de la familia Potyviridae, o

(iii) una VLP que comprende proteínas de cápsida de un virus de la familia Potyviridae para la inmovilización de un polipéptido B que comprende un enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática.

47. Uso según la reivindicación 46, en donde el virus de la familia Potyviridae es un Potyvirus.

48. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 ó 47 en donde el virus de la familia Potyviridae es el virus del mosaico del nabo (TuMV) .

49. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 a 48, en donde el enzima es una lipasa.

50. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, en donde el enzima es la lipasa B de Candida antarctica.

51. Un procedimiento para la conversión enzimática de un sustrato en un producto que comprende poner en contacto dicho sustrato con un biocatalizador según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o con un virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, o con una VLP según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en donde el enzima o fragmento del mismo que conserva su actividad enzimática presente en el polipéptido B del biocatalizador, o del virus o de la VLP, es un enzima que cataliza una reacción enzimática específica para la conversión de dicho sustrato en dicho producto, bajo condiciones adecuadas para que dicha reacción enzimática tenga lugar.

1. Activación 2. Conjugación

FIG. 1 A

FIG. 2

B

Estabilidad frente pH: TuMV 125 μg/ml

220 240 260 280 300 320 340 Longitud de onda (nm)

Estabilidad frente pH: TuMV 125 μg/ml

220 240 260 280 300 320 340 Longitud de onda (nm)

FIG. 2 (cont.)

Estabilidad según tampón de conjugación

Relación A250/A267

Relación A250/A267

D Estabilidad según proporción de acetonitrilo 2, 0 1, 8 1, 6 1, 4 1, 2 1, 0 0, 8 0, 6

7% 50%

FIG. 2 (cont.)

TuMV 500 μg⁄ml

TuMV 125 μg⁄ml

Relación A250/A267

E

FIG. 2 (cont.) FIG. 3 FIG. 4

FIG. 5

FIG. 5 (cont.)

C -x15K

E -x40K FIG. 6